焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(Pyrophosphate: fructose-6 – phosphate-1-phosphoric acid transferase,PFP)试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 :正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶试剂盒测定意义:
焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP,EC2.7.1.90)是一种胞质酶,广泛存在于植物组织中,催化果糖-6-磷酸与果糖-1,6-二磷酸之间的可逆转化,在光合作用碳代谢中起重要作用。
测定原理:
PFP催化6-磷酸果糖转化为1,6-二磷酸果糖,它在醛缩酶和磷酸丙糖异构酶的作用下转变为3-磷酸甘油醛,再由3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH催化生成3-磷酸甘油酸、NAD和磷酸,340nm处的吸光度变化反映了PFP的活性的高低。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿。
试剂组成和配制:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体30mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂三:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四:液体0.5mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂五:液体0.5mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂六:液体5mL×1瓶,4℃避光保存。
酶液提取:
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g离心10min,取上清置冰上待测。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后4℃,10000g离心10min,取上清置冰上待测。
3. 液体:直接检测。
测定操作:
1. 分光光度计预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2. 取1mL石英比色皿,依次加入580μL试剂一,100μL试剂二,100μL试剂三,10μL试剂四,10μL试剂五,100μL试剂六,100μL粗酶液,充分混匀,记录340nm处10s的吸光值A1和310s的吸光值A2,
△A=A1-A2
焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶试剂盒计算公式:
(1)按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP(nmol/min/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP(nmol/min /g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
(3)按照细胞数量计算
酶活单位定义:每104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP(nmol/min /104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T
=321.54×ΔA÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP(nmol/min /mL)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T=321.54×ΔA
V反总:反应体系总体积,1mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g
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