小鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)ELISA试剂盒

小鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)ELISA试剂盒性质、用途与生产工艺

检测类型

间接法

用途

本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)的含量。

种属

小鼠

检测原理

本试剂盒应采用双抗体夹心法测定标本中小鼠卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)水平。用纯化的卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)含量。  

样本

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。  

操作步骤

1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。    

特异性

可检测样本中小鼠的OVA-sIgE，且与其类似物无明显交叉反应。

背景信息

卵清蛋白(OVA)是在蛋清中发现的主要蛋白，约占总蛋白的55%。卵清蛋白与丝氨酸超家族的序列和三维有同源性，但与大多数丝氨酸不同，它不是丝氨酸蛋白酶抑制剂。它有385个氨基酸组成，其相对分子质量为42.7kDa。卵清蛋白从细胞中分泌出来，以内部信号序列（残基21-47）为目标，而不是其他分泌蛋白中常见的N端信号序列。

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