大鼠血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)ELISA试剂盒

大鼠血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)ELISA试剂盒性质、用途与生产工艺

应用

大鼠血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)ELISA试剂盒用于检测样本中血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)的含量。

实验原理

将目标抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的目标连接于固相载体上的抗体结合，然后加入微生物化的目标抗体，将未结合的生物素抗体洗净后，加入HRP标记和亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的目标呈正相关。用酶标仪在1333nm波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓度。

用途

本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)的含量。  

检测原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定大鼠标本中血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)水平。用纯化的血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)含量。  

样本

1、组织标本 对于样本要求保持鲜重，称取样本中的重量不小于50mg，一般以1g为基准,但不严格要求固定样本每个重量必须达到相同的水平。匀浆的比例选取10%，相当于1g组织加9ml的匀浆液来进行匀浆。匀浆液选取PBS（PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol/L）。匀浆过程选用组织匀浆器，冰浴上匀浆。(或者进行液氮碾磨)，离心取上清，离心转速选用5000转每分，时间是15分钟。取上清液待检。 2-1、贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细 胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS 洗涤3次。每 1×106 个细胞中加入150-200μL PBS重悬并通过反 复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清检测。 2-2超声波破碎条件：用20kHz频率，150W的功率，在冰浴中进行超声波破碎，每破碎2s，间隔3s，反复破碎三次。 2-3反复冻融：收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-20℃ 冷冻30 min，37℃解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。 3、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 4、不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。  

操作步骤

1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），测定应在加终止液后15分钟以内进行。    

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