细胞计数试剂盒
细胞计数试剂盒 性质
| 储存条件 | 2-8°C |
|---|
细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）是一种基于 WST-8 在电子耦合试剂存在 的情况下，被线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜产物（formazan），生成的甲臜物的 数量与活细胞的数量成正比，使用酶标仪在 450nm 波长处测得的吸光值即可间接反映活细 胞的数量。细胞增殖越快，则颜色越深，细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。CCK-8 广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度 检测。
BDBIO 细胞计数试剂盒（CCK8）仅一管已经配制好的含有 WST-8 的 CCK-8 溶液，无须再 进行任何配制操作，并且不必洗涤或收集细胞，使用便捷，加入 CCK-8 溶液显色后，可以在 不同时间反复用酶标仪读板，检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间，可以用于大批量 样品的检测。细胞计数试剂盒 (CCK) 用于活细胞数量荧光检测。其检测原理是通过细胞内的酯酶催化钙黄绿素乙酰甲酯(3′,6′-Di(O-acetyl)-2′,7′-bis[N,N-bis-(carboxymethyl) aminomethyl]-fluorescein, tetraacetoxymethyl ester)产生荧光染料钙黄绿素，后者的数量和细胞培养基内的活细胞数量成正比。由于分子中含有高度亲脂性的乙酰基团，钙黄绿素乙酰甲酯能迅速透过细胞膜进入细胞质。这种检测方法无需任何放射性同位素标记(如[3H]- thymidine掺入法)或溶解步骤(如MTT检测)。因此可获得高度可重复性和精确性的细胞增殖检测结果。一、制作标准曲线
1. 细胞铺板：对收集的细胞悬液进行计数，然后接种细胞；
2. 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 5-7 个细胞浓度梯度，每组 4-6 个复孔；
3. 接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后每 100μL 培养基加 10μL（培养基体积的 10%） CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD 值为纵 坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前 提条件是试验条件完全一致）。
二、细胞活性检测
1. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；
2. 向每孔加入 10μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡) ；
3. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；
4. 用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。
三、细胞增殖-毒性检测
1. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；
2. 向培养板加入不同浓度的待测药物；
3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；
4. 向每孔加入 10μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡)；
5. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；
6. 用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。
四、计算公式 细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0 加药）-A（空白）]×100
A（加药）：具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和 CCK-8 溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0 加药）：具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力1. 酚红和血清对 CCK-8 的检测不会造成干扰，可通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去， 因此不会对检测造成影响。
2. 若细胞毒性非常低，加入 WST-8 显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最 佳测定时间。
3. 如果待测物质有氧化性或还原性，可在加 CCK-8 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并 用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的 情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
4. 加入药物中如含有金属，对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、 硫酸铜会抑制 5% 、15% 、90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是 10mM 将会 100%抑制。
5. 不同的细胞系，加入 CCK-8 试剂后的反应时间不同，建议先做几个孔摸索接种细胞的数 量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。
6. 当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1000 个/孔 (100μL 培养基)。检 测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2500 个/孔 (100μL 培养基)。如 果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积 的 10%加入 CCK-8 溶液。
7. 建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。同时避免产生气泡，否则会干扰 OD 值读数。
8. 白细胞可能需要培养较长时间。
9. 使用 96 孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，需要注意蒸发问题，可以采取弃用周 围一圈的办法，改加相同量的 PBS 、水或培养液。
10.以下方法可以终止 CCK-8 反应 (96 孔板)：(a). 在显色反应后，将培养板放置 4°C 冰箱 内。(b). 每孔加 10μL 0.1M HCl 溶液。(c). 每孔加 10μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫 酸钠) 溶液，反应停止后，应在 24 小时内测定。
11.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
1. 细胞铺板：对收集的细胞悬液进行计数，然后接种细胞；
2. 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 5-7 个细胞浓度梯度，每组 4-6 个复孔；
3. 接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后每 100μL 培养基加 10μL（培养基体积的 10%） CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD 值为纵 坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前 提条件是试验条件完全一致）。
二、细胞活性检测
1. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；
2. 向每孔加入 10μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡) ；
3. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；
4. 用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。
三、细胞增殖-毒性检测
1. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；
2. 向培养板加入不同浓度的待测药物；
3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；
4. 向每孔加入 10μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡)；
5. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；
6. 用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。
四、计算公式 细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0 加药）-A（空白）]×100
A（加药）：具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和 CCK-8 溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0 加药）：具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力1. 酚红和血清对 CCK-8 的检测不会造成干扰，可通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去， 因此不会对检测造成影响。
2. 若细胞毒性非常低，加入 WST-8 显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最 佳测定时间。
3. 如果待测物质有氧化性或还原性，可在加 CCK-8 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并 用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的 情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
4. 加入药物中如含有金属，对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、 硫酸铜会抑制 5% 、15% 、90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是 10mM 将会 100%抑制。
5. 不同的细胞系，加入 CCK-8 试剂后的反应时间不同，建议先做几个孔摸索接种细胞的数 量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。
6. 当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1000 个/孔 (100μL 培养基)。检 测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2500 个/孔 (100μL 培养基)。如 果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积 的 10%加入 CCK-8 溶液。
7. 建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。同时避免产生气泡，否则会干扰 OD 值读数。
8. 白细胞可能需要培养较长时间。
9. 使用 96 孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，需要注意蒸发问题，可以采取弃用周 围一圈的办法，改加相同量的 PBS 、水或培养液。
10.以下方法可以终止 CCK-8 反应 (96 孔板)：(a). 在显色反应后，将培养板放置 4°C 冰箱 内。(b). 每孔加 10μL 0.1M HCl 溶液。(c). 每孔加 10μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫 酸钠) 溶液，反应停止后，应在 24 小时内测定。
11.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。