细胞侵袭

细胞侵袭与细胞迁移比较类似，但是“侵袭”需要细胞穿过胞外基质层（ECM）或基底膜基质层（BME），在这个过程中细胞先酶解去除ECM/BME的阻碍，从而在趋化因子浓度梯度的驱使下完成从一处到另一处的移动。常用来评估肿瘤细胞在正常组织中转移的能力，但正常细胞，如巨噬细胞也有相同的能力。细胞体外侵袭实验主要应用于各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响及一些抑制血管生成的新药研究。Transwell侵袭实验是检测肿瘤细胞侵袭能力最常用的实验方法，其原理是用一层聚碳酸酯膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞接种到低营养的培养液里，通常膜孔都被Matrigel覆盖，模仿细胞外基质，肿瘤细胞必须分泌水解酶并通过变形运动才能穿过铺有Matrigel的滤膜，计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭能力。

1、ECM Gel原液提前1h放在4℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。

2、将1.5 mL EP管、枪头和细胞小室（已先行放入孔板中），置于冰上预冷。

3、根据自己的使用量，按照ECM Gel:无血清培养基=1:7.5在冰上稀释成使用液。

4、把枪头剪去一小段（约3µm）后在冰上吸取40µL/孔ECM Gel使用液轻轻加入小室的上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。

5、放在37℃孵箱15min，让胶凝固。

6、消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104/mL用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。

7、按照每孔200µL，将细胞悬液加入上室，同时在下室加入10%FBS+培养基500µL，放入37℃孵箱培养。

8、若干小时后取出，吸去上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。

9、在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。

10、在正置显微镜上放置一块载玻片，将细胞小室倒置放在上面，拍照。

11、在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。