小伙伴们，是不是在使用Fluo-4AM的操作过程中，常出现一些问题，导致实验数据不理想？小萤总结了四大典型问题及其解决方案，助您扫清障碍，获得可靠数据。
一、细胞损伤：如何保障细胞的“真实状态”？
加载过程本身可能对细胞造成应激甚至损伤，影响数据的生理相关性。
核心原因：DMSO毒性、染料浓度过高或多重染色压力。
解决方案：
从健康细胞开始：状态良好的细胞对实验操作的耐受性更强。
正确稀释染料：务必先将Fluo-4 AM储备液与无血清培养基充分混合，再加入细胞，以降低DMSO的损害。
简化染色流程：对于需要进行复杂成像实验，推荐使用可同步追踪多种离子的单一荧光探针（如Mag-Fluo-4 AM），以此减轻细胞应激反应。
二、信号微弱：为何我的信号“弱不禁风”？
信号强度不足会严重影响信噪比和数据可靠性。
核心原因：
实验体系未优化：自建方案可能存在未知缺陷。
染料浓度不当：浓度过高会导致淬灭，过低则信号不足。
Kd值不匹配：染料的解离常数与待测钙离子浓度范围不匹配。
解决方案：
验证实验体系：使用标准化钙检测试剂盒进行对比，快速定位问题根源。
优化染料浓度：通过浓度梯度测试确定合适浓度，并尽可能采用低的有效摩尔浓度，避免淬灭和毒性。
选择匹配的探针：Fluo-4 (Kd ≈ 345 nM) 适用于胞质钙快速变化。若您的实验涉及不同浓度范围的钙信号，可换用更匹配的探针：Calbryte™ 520 AM (Kd ≈ 1200 nM)或者Fluo-8FF™ AM (Kd ≈ 10000 nM)
面对Fluo-4 AM的挑战，一个系统化的解决方案至关重要。从优化基础方案，到在关键节点升级探针（Fluo-8® AM、Mag-Fluo-4 AM），再到针对特定浓度范围选择高匹配度工具（如Calbryte™ 520 AM、Fluo-8FF™ AM），百萤生物为您提供全方位支持。
采用 Calbryte™ 520 AM（#20653）和 Fluo-4 AM（#20550）检测 CHO-K1 细胞的 ATP 反应。实验方法如下：
将 CHO-K1 细胞以每孔 50,000 个细胞 / 100 µL 的密度接种到 96 孔板 或透明底 Costar 培养板中，过夜培养。向各孔中加入 100 µL 染料加载液（含 10 µg/mL Calbryte™ 520 AM 的 HH 缓冲液，或含 10 µg/mL Fluo-4 AM 的 HH 缓冲液，两种缓冲液均添加丙磺舒），在 37°C 条件下孵育 45 分钟。移除两种染料加载液后，每孔加入 200 µL HH 缓冲液。随后加入 50 µL 每孔的 ATP，使终浓度达到所示的 10 µM。使用 显微镜在 FITC 通道采集图像。