关节炎（CIA）模型的建立

 构建关节炎（CIA）大鼠模型

CIA是用牛II型胶原免疫诱导构建的

• 选择8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠

• CIA建立前，采用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠

  。

• II型胶原在0.05 mol/L乙酸中溶解至4mg /mL。

• 采用电动均质器，将等量的不完全弗氏佐剂乳化制备胶原蛋白

  。

• 取0.1 mL乳状液分别于第0天和第7天皮下接种CIA大鼠

  。

• No.2

  成纤维样滑膜细胞（FLSs）的分离和鉴定

  成纤维样滑膜细胞（FLSs）的分离

  从CIA大鼠滑膜标本中分离FLSs细胞：

  实验前采用颈椎脱位安乐死。用胶原酶消化法获得FLSs细胞，用含1%氨苄西林和链霉素的PBS在冰上冲洗滑膜组织5次，然后将滑膜组织切片成1 mm3厚的薄片，置于含有0.2% II型胶原酶的培养皿中，并放置37℃培养箱。

  整个过程中，每60min收集上清，1200 rpm离心5min，收集细胞颗粒，用培养基悬浮后，完全培养基培养，后经过200目不锈钢过滤器过滤，以1*105/cm2的密度接种在细胞培养瓶中，并在5% CO2、37℃培养箱中继续培养。当达到90%融合时，传代细胞，第2代细胞用于后续实验。

   

  成纤维样滑膜细胞（FLSs）的鉴定

  用Vimentin（波形蛋白）抗体对分离得到的FLSS细胞进行鉴定，将第2代FLSS细胞接种在细胞培养板中的载玻片上。

  培养3天后，除去上清液，用4％多聚甲醛固定FLSS 20 min、TritonX渗透20 min、3％H2O2处理15 min，再用5％BSA孵育20 min后，将切片与抗-Vimentin抗体置湿盒中4℃孵育过夜。

  第二天用PBS 3 min×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS，滴加生物素化二抗工作液，室温置湿盒中孵育20 min，用PBS 5min×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS，DAB显色剂显色，自来水充分冲洗后进行苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。