【试剂盒技术指标】
中文名称：口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒
产品规格：96孔/盒
品 牌：臻科研
检测方法：酶联免疫法
检测时间：45min
独特优势：灵敏度高、特异性强、重复性好
用 途 ：科研实验专用，不得用于临床诊断。
货期供应：2个工作日
特别说明：产品保证质量有任何质量问题包退换，欢迎大家前来选购。
存 储 ：2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻
保质期 ：12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。
【用途】
用于检测牛、羊和猪等偶蹄动物血清样品中口蹄疫病毒O型抗体，适用于动物疫苗免疫抗体定量检测。
【规格】1*96T/盒或5*96T/盒
【试剂盒组成】
组成成份 | 规格 | 规格 |
包被板 | 1块（96孔/块） | 5块（96孔/块） |
酶标抗体（绿盖） | 1瓶（12ml/瓶） | 1瓶（60ml/瓶） |
20×洗涤液（黄盖） | 1瓶（24ml/瓶） | 2瓶（60ml/瓶） |
口蹄疫O型抗原（蓝盖） | 1瓶（6ml/瓶）已稀释至工作浓度 | 1瓶（30ml/瓶）已稀释至工作浓度 |
阳性对照 | 1管（0.2ml/管）已稀释浓度为1:8 | 1管（1ml/管）已稀释浓度为1:8 |
阴性对照 | 1管（0.2ml/管） | 1管（1ml/管） |
底物A液 | 1瓶（6ml/瓶） | 1瓶（30ml/瓶） |
底物B液 | 1瓶（6ml/瓶） | 1瓶（30ml/瓶） |
终止液（红盖） | 1瓶（6ml/瓶） | 1瓶（30ml/瓶） |
说明书 | 1份 | 1份 |
板贴 | 1张 | 5张 |
注：不同批号试剂盒中各组分不得混用。
【贮藏条件及有效期】2～8℃保存，有效期为12个月。
【用法与判定】
在使用前，所有的试剂盒组份应恢复到室温。试剂应轻轻旋转或振荡混匀。
1．试剂准备
洗涤液配制：将浓缩20×洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释成洗涤液(1×)，即1份浓缩20×洗涤液加入19份蒸馏水，配制的洗涤液(1×)用于洗板和血清样品稀释。
病毒抗原：口蹄疫O型抗原已稀释至工作浓度，直接使用。
2．操作步骤
取出包被板，根据不同的需要，选择图1或图2中的一种布局进行操作。图1为可检测10份样品布局图；图2为可检测20份样品布局图。每次试验，每板均需设置阴阳性血清对照及4孔不加血清单病毒抗原对照。
2.1待检样品稀释：
以图1为例操作，首先，在包被板上，A1～A10每孔各加75µl的洗涤液(1×)，在第1～11列其它所有孔以及第12列的A12～B12内各加入50µl的洗涤液(1×)。其次，再在A1～A10每孔各加25µl的待检样品，A11孔加50µl的阳性对照，A12孔加50µl的阴性对照，然后，以50µl/孔的量，用洗涤液(1×)连续2倍稀释每份被检血清，使每孔最终量都为50µl；
待检样品A1～A10分别以50µl/孔的量从A到H连续2倍稀释；
阳性对照A11以50µl/孔的量从A到H连续2倍稀释；阴性对照A12以50µl/孔的量从A到B连续2倍稀释。E12~H12孔为病毒抗原对照孔。
待检样品在第1～10列从1:4稀释至1:512；阳性对照，从1:2稀释至1:256，由于试剂盒提供的阳性对照已1:8稀释，则变为从1:16稀释至1:2048；阴性对照，从1:2稀释至1:4。
图1 96孔包被板检测10份样本布局图
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
A | S1 1:8 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | +1:32 | -1:4 |
B | 1:16 |
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| 1:64 | 1:8 |
C | 1:32 |
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| 1:128 |
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D | 1:64 |
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| 1:256 |
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E | 1:128 |
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| 1:512 | 病 |
F | 1:256 |
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| 1:1024 | 毒 |
G | 1:512 |
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| 1:2048 | 抗 |
H | 1:1024 |
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| 1:4096 | 原 |
以图2为例操作，首先，在包被板上，A1～A10孔以及E1～E10孔，每孔各加87.5µl的洗涤液(1×)，在第1～11列其它所有孔以及第12列的A12～B12内各加入50µl的洗涤液(1×)。其次，再在A1～A10孔以及E1～E10孔，每孔各加12.5µl的待检样品，A11孔加50µl的阳性对照，A12孔加50µl的阴性对照，然后，以50µl/孔的量，用洗涤液(1×)连续2倍稀释每份被检血清，使每孔最终量都为50µl；
待检样品A1～A10分别以50µl/孔的量从A到D连续2倍稀释；待检样品E1～E10分别以50µl/孔的量从D到H连续2倍稀释；
阳性对照A11以50µl/孔的量从A到H连续2倍稀释；阴性对照A12以50µl/孔的量从A到B连续2倍稀释。E12~H12孔为病毒抗原对照孔。
待检样品在第1～10列从1:8稀释至1:64；阳性对照，从1:2稀释至1:256，由于试剂盒提供的阳性对照已1:8稀释，则变为从1:16稀释至1:2048；阴性对照，从1:2稀释至1:4。
图2 96孔包被板检测20份样本布局图
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
A | S1 1:16 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | +1:32 | -1:4 |
B | 1:32 |
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| 1:64 | 1:8 |
C | 1:64 |
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| 1:128 |
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D | 1:128 |
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| 1:256 |
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E | S11 1:16 | S12 | S13 | S14 | S15 | S16 | S17 | S18 | S19 | S20 | 1:512 | 病 |
F | 1:32 |
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| 1:1024 | 毒 |
G | 1:64 |
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| 1:2048 | 抗 |
H | 1:128 |
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| 1:4096 | 原 |
2.2加病毒抗原：使用已稀释好的口蹄疫O型抗原加样，其中预设的4孔病毒抗原对照孔按100µl/孔加入，其余待检血清、阴阳性对照按50µl/孔加入。加样完毕，所有样品孔和阴阳性对照孔稀释度翻倍，变为图1、图2所示。振荡混匀，封板，37℃温育30分钟。
2.3洗板后加酶：弃去孔中液体，用洗涤液(1×)以300µl/孔的量连续洗涤4次，拍干孔中残留液体。然后按100μl/孔加入酶标抗体，振荡混匀，封板，37℃温育30分钟。
2.4洗板后加底物：弃去孔中液体，用洗涤液(1×)以300µl/孔的量连续洗涤4次，拍干孔中残留液体。然后100μl/孔加入底物溶液(显色液A和B按1:1混合均匀)，封板，37℃避光温育15分钟。
2.5终止后读数：按50μl/孔加入终止液终止反应，立即在450nm波长下读取OD值。
3．结果判定
3.1试验成立条件
每块板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照OD450nm值应在1.0以上。阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应<1:8。
3.2血清抗体效价的判定
病毒抗原对照4孔，弃去最高和最低OD450nm值，计算剩余2孔的平均OD450nm值，再除以2，即50%对照值，该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD450nm值。被检血清OD450nm值>临界值的孔，判为阴性孔；被检血清OD450nm值≤临界值的孔，判为阳性孔。
若临界值与稀释倍数最高阳性孔的OD450nm值相同，则以被检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于2孔之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值，如处于1:64(反对数值为1.8）与1:128（反对数值为2.1）之间，则判定该份血清的抗体效价为1:90（反对数值为1.95），具体判定可见抗体效价计算对照表。
抗体效价计算对照表
抗体效价 | Log10（效价） 对照计算 | 抗体效价 | Log10（效价） 对照计算 | 抗体效价 | Log10（效价） 对照计算 |
1:4 | 0.6 | 1:32 | 1.5 | 1:256 | 2.4 |
1:6 | 0.75 | 1:45 | 1.65 | 1:360 | 2.55 |
1:8 | 0.9 | 1:64 | 1.8 | 1:512 | 2.7 |
1:11 | 1.05 | 1:90 | 1.95 | 1:720 | 2.85 |
1:16 | 1.2 | 1:128 | 2.1 | 1:1024 | 3 |
1:22 | 1.35 | 1:180 | 2.25 | 1:1440 | 3.15 |
3.3结果判定
阳性：血清样品抗体效价≥1:128，判为口蹄疫O型抗体阳性；
阴性：血清样品抗体效价＜1:64，判为口蹄疫O型抗体阴性；
可疑：血清样品抗体效价在1:64-1:128之间，判为可疑；可疑血清样品需要复检，复检抗体效价≥1:128，判为阳性；抗体效价＜1:128，判为阴性。
3.4 ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系
牛、羊：抗体效价≥1:128，99%以上保护；效价≤1:16，不保护；效价在1:22~90之间，50%保护。
猪：≥1:64，99%以上保护；效价<1:4，不保护；效价在1:4~45，50%保护。
【注意事项】
1. 实验前请仔细阅读本说明书。
2. 使用前需确认试剂盒有效期，应在有效期内使用。
3. 所有试剂使用前恢复至室温(18～26℃)，以免温度过低影响抗原抗体反应。
4. 试剂盒所有浓缩试剂在低温放置下，可能有无机盐结晶，如果有结晶盐出现，可在37℃温育至溶解后使用，不影响实验。
5. 实验前应用温度计检查温箱温度，温度过高或过低影响OD值高低。
6. 待检血清样品数量较多时，应尽量缩短加样时间。
7. 包被板反应时严禁堆叠放置，应该平铺且板间有空隙，不要离温箱壁太近。
8. 终止反应后应立即用酶标仪读数，应在10分钟内完成。
9. 实验所用移液器及设备应定期校准。
10. 采集的样品要新鲜，并且最好不要溶血。血清标本在2～8℃放置不要超过2天，室温不超过8小时，如需长时间放置应储存于-20℃。
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