琥珀酸脱氢酶（SDH）检测试剂盒（微量法100T/96S）

  琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）试剂盒说明书

                                                  微量法 100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

SDH（EC 1.3.5.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上的一种膜结合酶，是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。此外，为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。

测定原理：

SDH催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的变化，测定2．6-DPIP的还原速度，代表SDH酶活性。

组成：

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1ml试剂一和10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2. 将匀浆600g，4℃离心5min。

3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的SDH（此步可选做）。

5. 在步骤④的沉淀中加入200μl试剂二和2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体SDH活性测定。

测定步骤和加样表：

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。

2. 样本测定

（1）在试剂四中加入18ml蒸馏水充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

（2）在试剂五中加入1ml蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl样本、10μl试剂五和180μl试剂四，混匀，立即记录600nm处20s时的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

SDH活性的计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

 SDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=952×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=192×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.385×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

 SDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=384×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.77×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。