129030-36-0；Digoxigenin-11-dUTP

129030-36-0；Digoxigenin-11-dUTP

Digoxigenin-11-dUTP 是用于 DNA 而非 RNA 的非放射性标记。它是一种关键的分子生物学试剂，用于制备地高辛标记的DNA探针。

核心功能：DNA探针的标记

Digoxigenin-11-dUTP 是一种修饰的脱氧核苷酸：

• dUTP部分：是合成DNA的基本构建单元之一（脱氧尿苷三磷酸）。

• Digoxigenin部分：作为半抗原标记物。

• “11-”连接臂：将地高辛连接到碱基上，以最小化对DNA聚合酶活性的干扰。

主要应用领域

由于其标记对象是DNA，它被广泛应用于所有需要DNA探针的检测技术中：

1. 原位杂交（特别是DNA原位杂交）

• 检测染色体/DNA序列：用于定位基因组中的特定DNA序列，如基因拷贝数变异、染色体上的基因定位（基因作图）、病毒DNA在细胞或组织中的检测等。

• 过程：通过酶促反应将Digoxigenin-11-dUTP掺入DNA探针。该探针与经变性处理的样品DNA杂交后，用抗地高辛抗体进行免疫检测。

2. Southern Blot

• 用于检测特定DNA序列的存在、大小和拷贝数。

• 用地高辛标记的DNA探针与固定在膜上的基因组DNA进行杂交，通过化学发光或显色法检测。这是放射性同位素标记的常用替代方案。

3. DNA微阵列/CGH（比较基因组杂交）

• 用于基因分型或检测DNA拷贝数变化。样品DNA（如肿瘤基因组DNA）可以用Digoxigenin-11-dUTP标记，然后与芯片上的探针杂交。

4. 荧光原位杂交

• 虽然FISH常用直接荧光标记，但地高辛标记的探针与偶联了荧光染料的抗地高辛抗体结合，也是一种有效的间接FISH策略，尤其适用于信号扩增或多色检测。

工作原理（如何掺入DNA）

与UTP用于RNA聚合酶不同，dUTP需要被DNA聚合酶识别和利用。主要掺入方法有：

• 缺口平移：传统方法，使用DNase I和DNA聚合酶I在DNA链上制造缺口并替换核苷酸，掺入标记的dUTP。

• 随机引物标记：更常用的高效方法。使用随机六聚体引物和Klenow片段（DNA聚合酶I的大片段），以变性DNA为模板，合成含有标记dUTP的新链。

• PCR标记：最便捷的方法。在PCR反应体系中，将一定比例的普通dTTP替换为Digoxigenin-11-dUTP，Taq DNA聚合酶会将其掺入到扩增产物中，从而直接得到标记的DNA探针。

• 末端标记：使用末端脱氧核苷酸转移酶 在DNA片段的3‘端添加一个或多个标记的dUTP，适用于标记寡核苷酸探针。

检测方式

与Digoxigenin-11-UTP完全相同：

1. 探针与靶标DNA杂交。

2. 用抗地高辛抗体（偶联碱性磷酸酶AP或辣根过氧化物酶HRP）结合。

3. 通过酶促底物产生：

• 化学发光信号（如CSPD for AP；ECL for HRP）：用于印迹杂交，灵敏度极高。

• 显色信号（如NBT/BCIP for AP；DAB for HRP）：用于原位杂交或印迹杂交，可直接肉眼或光学显微镜观察。

主要优势

• 安全性：替代放射性³²P-dCTP。

• 高稳定性：探针可长期保存。

• 高灵敏度与低背景：免疫检测系统特异性强。

• 多功能性：适用于从膜杂交到原位检测的所有DNA分析技术。

总结与对比 Digoxigenin-11-UTP

核心结论：
Digoxigenin-11-dUTP 是专门用于将地高辛半抗原标记掺入到DNA分子中的底物。它是制备非放射性DNA探针的核心试剂，广泛应用于检测和定位特定DNA序列的各种分子生物学技术中，是基因组研究、病理诊断和基础研究的重要工具。选择使用dUTP还是UTP，完全取决于您需要标记和检测的对象是DNA还是RNA。