草果探针法PCR鉴定试剂盒

技术原理

基于实时荧光定量PCR（qPCR）探针法，通过Taq酶的5'→3'核酸外切酶活性切割探针，释放荧光信号。探针5'端标记荧光报告基团（如FAM），3'端标记淬灭基团，扩增过程中荧光强度与靶序列含量成正比，实现定量/定性分析。

产品特点

高灵敏度与特异性：引物及探针针对草果保守序列设计，避免交叉反应。

即开即用：预混缓冲液、酶、引物及探针，仅需提供RNA/DNA模板。

内置对照：含阳性对照（无传染性DNA片段，1×10^8拷贝/μL），便于排除假阴性。

双重应用：支持定量（标准曲线法）和定性检测（Ct值判读）。

试剂盒组成

| 成分 | 规格 | 规格 |

| qRT-PCR缓冲液 | 500μL | 500μL |

| qRT-PCR酶混合液 | 100μL | 50μL |

| 荧光模板稀释液 | 1mL | 1mL |

| 引物混合液 | 100μL | 干粉（50T） |

| 探针 | 50μL | 50μL |

| 阳性对照 | 50μL（1×10^8拷贝/μL） | 50μL（1×10^7拷贝/μL） |

操作步骤

1. 标准曲线制备（以10倍梯度稀释为例）：

标记离心管（7至2号），依次稀释阳性对照至10^2~10^7拷贝/μL，冰上保存。

2. 样本处理：

提取样本RNA/DNA（推荐柱式提取法），设置阴性（NC）和阳性对照（PC）。

3. qPCR反应体系（20μL/管）：

| 成分 | 样品管（μL） | 阴性对照（μL） | 标准曲线管（μL） |

| qRT-PCR缓冲液 | 10 | 10 | 10 |

| 酶混合液 | 2 | 2 | 2 |

| 探针 | 1 | 1 | 1 |

| 引物混合液 | 2 | 2 | 2 |

| 模板 | 5（样本） | - | 5（标准品） |

| 超纯水 | - | 5 | - |

4. 反应程序：

逆转录：50℃ 30分钟（仅RNA模板需此步骤）。

预变性：94℃ 10分钟。

扩增（40循环）：94℃ 15秒 → 60℃ 1分钟（采集FAM信号）。

数据分析

定量检测：以标准品log拷贝数为横轴、Ct值为纵轴绘制曲线，计算样本浓度。

定性检测：

阳性：Ct≤35或≤39，且扩增曲线呈S型。

阴性：Ct≥40，或无扩增。

灰区（35~40）：需重复检测。

注意事项

分区操作：样本制备、试剂配制、扩增需在独立区域进行，避免交叉污染。

质量控制：每次实验需包含阴/阳性对照。

局限性：

基因突变或提取效率低可能导致假阴性。

污染或试剂失效可能导致假阳性。

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