产品概述
本试剂盒采用探针法荧光定量RT-PCR技术，专用于检测猪生殖与呼吸综合症病毒美洲型经典株(Classical Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, C-PRRSV)。该产品具有高灵敏度和高特异性，适用于科研用途，不用于临床诊断。
产品名称 | 猪生殖与呼吸综合症病毒美洲型经典株探针法荧光定量RT-PCR试剂盒 | 英文名称 | Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus American Classic Strain Probe-based Real-time RT-PCR Kit |
产品规格 | 50T | 产品分类 | 荧光定量PCR |
检测类型 | PCR检测 | 产品货号 | PR5224 |
产品特点
即开即用：用户只需提供样品RNA模板
高灵敏度：引物和探针经过优化设计
高特异性：针对C-PRRSV高度保守区设计，不与其它病毒RNA发生交叉反应
双重功能：既可用于定性检测，也可用于定量分析
质量控制：提供阳性对照，便于区分假阴性样品
标准配置：足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应
技术原理
本试剂盒采用TaqMan探针技术，利用Taq酶的5'核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针。探针5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止延伸。当引物延伸至探针结合位置时，Taq酶切割探针使报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。通过实时监测荧光强度变化，实现对起始模板的定量分析。
包装规格
| 编号 | 成分 | 规格 |
| 试剂一 | 探针法qRT-PCR缓冲液 | 500μL |
| 试剂二 | 探针法qRT-PCR酶混合液 | 100μL |
| 试剂三 | 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 试剂四 | C-PRRSV探针法qRT-PCR引物混合液 | 100μL |
| 试剂五 | C-PRRSV qRT-PCR探针 | 50μL |
| 试剂六 | C-PRRSV阳性对照(1×10⁸拷贝/μL) | 50μL |
操作流程
标准曲线样品制备(以10²-10⁷拷贝/μL为例)
标记6个离心管(7-2号)，各加入45μL模板稀释液
7号管加入5μL阳性对照(1×10⁸拷贝/μL)，震荡混匀得1×10⁷拷贝/μL标准品
依次进行10倍系列稀释至2号管，获得6个浓度梯度的标准曲线样品
样品RNA制备
建议设置N+2个提取(N样品+阳性对照+阴性对照)
使用兼容的RNA提取试剂盒纯化样品RNA
qRT-PCR反应设置(20μL体系)
| 成分 | 样品管(N+2) | 阴性对照管 | 标准曲线管(2-7) |
| qRT-PCR缓冲液 | 10μL | 10μL | 10μL |
| 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
| 探针 | 1μL | 1μL | 1μL |
| 引物混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
| RNA模板 | 5μL | - | - |
| 超纯水 | - | 5μL | - |
| 标准品 | - | - | 5μL |
PCR反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 逆转录 | 50℃ | 30分钟 |
| 预变性 | 94℃ | 10分钟 |
| PCR循环(40次) | 94℃ | 15秒 |
| | 60℃ | 1分钟(采集荧光信号) |
数据分析
定量分析
以阳性对照浓度的log值为横轴，Ct值为纵轴绘制标准曲线
根据样品Ct值推算核酸浓度
定性分析
阴性对照Ct≥40
阳性对照Ct≤39且有典型扩增曲线
样品Ct≤39判为阳性，Ct≥40判为阴性
39<Ct<40需重复检测
储存条件
-20℃保存，有效期12个月。避免反复冻融。
注意事项
操作需在不同区域进行，防止交叉污染
使用前所有组分应完全融化并混匀
反应液需避光保存
避免产生气泡，确保管盖密封
使用一次性耗材和防护装备
实验后对工作台和仪器进行消毒处理
本产品仅限科研使用
局限性
检测结果受样品采集、处理、运输和保存条件影响
提取过程中的污染可能导致假阳性
病毒基因突变可能导致假阴性
不同提取方法效率差异可能影响结果
试剂保存或配制不当可能降低检测效能
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