检测目标：特异性检测斑点叉尾鮰病毒（Channel Catfish Virus, CCV），一种引致鮰鱼幼鱼高死亡率（可达90%）的疱疹病毒，主要攻击肾脏和脾脏组织。
方法原理：基于恒温荧光扩增技术（如RT-LAMP或RPA），靶向CCV的胸苷激酶（TK）基因保守区，通过荧光染料（如SYTO 9）实时监测扩增信号，60-65℃恒温反应，无需热循环仪。
适用样本：鱼体组织（肾、脾）、鱼苗匀浆液、养殖水体滤膜。
2. 检测流程
样本处理
组织样本：取50 mg肾脏/脾脏液氮研磨，加入裂解液（含蛋白酶K）消化。
水体样本：0.45 μm滤膜过滤浓缩病毒颗粒。
DNA提取
快速磁珠法或煮沸法提取，避免DNA降解。
恒温扩增
反应体系：
引物：6条特异性引物（靶向TK基因）。
荧光染料：SYTO 9（实时监测）或羟基萘酚蓝（HNB，终点显色）。
反应条件：65℃ 30分钟，荧光信号每30秒采集一次。
结果判读
阳性：荧光曲线呈指数增长（ΔRn≥0.5）。
阴性：无显著荧光升高（需排除抑制物干扰）。
3. 性能参数
指标 参数要求
灵敏度 ≤100 copies/μL
特异性 不与IHNV（传染性造血器官坏死病毒）交叉
检出限 95%检出率（10^2 copies/mg组织）
抗干扰性 耐受10%鱼体黏液或水体腐殖酸
4. 注意事项
假阴性控制：
潜伏感染期病毒载量低，建议检测多器官（如肾+脾）。
水体样本需超滤浓缩（50倍）以提高灵敏度。
生物安全：操作需在BSL-2实验室进行，避免气溶胶扩散。
质控要求：每批次含阴性对照（健康鮰鱼组织DNA）、阳性对照（CCV质粒）。
5. 应用场景
养殖场防控：
鱼苗引进前的检疫（阻断垂直传播）。
暴发性死亡事件的病原确诊（如幼鱼螺旋式游动症状）。
科研监测：CCV流行毒株的分子变异追踪。
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