该试剂盒主要用于科研领域（如兽医研究、免疫学研究、药理学研究），通过荧光定量PCR（qPCR）技术，检测样本（猪的血液、组织、细胞）中pNOS（或iNOS）基因的mRNA表达水平。
应用场景：
评估猪只的免疫状态或炎症反应程度。
研究药物或疫苗对猪免疫系统的影响（是否诱导了iNOS的表达）。
检测细胞因子风暴或败血症模型中的基因表达变化。
2. 检测原理（PCR-荧光探针法）
该技术也称为TaqMan探针法，是一种高特异性的定量PCR技术。
原理详解：
逆转录（RT）：首先将提取的样本RNA反转录成cDNA。
PCR扩增：在PCR反应体系中，除了引物外，还加入了一条特异性的荧光探针。
荧光信号：该探针两端分别标记了荧光报告基团（Reporter, R，如FAM）和荧光淬灭基团（Quencher, Q）。在探针完整时，荧光被淬灭。
信号释放：PCR扩增过程中，Taq酶的5'-3'外切酶活性会将探针切断，使报告基团与淬灭基团分离，从而发出荧光。
定量：荧光信号的强弱（Ct值）与起始模板的数量成正比。
3. 试剂盒典型组成
一个标准的pNOS (iNOS) 荧光定量PCR试剂盒（以50次反应为例）通常包含以下组分：
组分名称 规格 作用 保存条件
2× qPCR Mix 500 μL 含dNTPs、Taq酶、Mg2、缓冲液 -20℃
pNOS 引物&探针混合液 50 μL 针对猪（或特定物种）iNOS基因设计的特异性序列 -20℃
内参基因 (如GAPDH/β-actin) 50 μL 用于数据标准化，消除样本量差异 -20℃
阳性对照 (标准品) 100 μL 含pNOS基因片段的质粒，用于绘制标准曲线 -20℃
ROX Reference Dye 50 μL 校正荧光定量PCR仪的孔间误差 (视仪器而定) -20℃
4. 操作流程详解
第一步：样本准备
样本类型：猪全血（抗凝）、脾脏、肺脏组织、巨噬细胞等。
RNA提取：使用RNA提取试剂盒提取总RNA，并检测浓度和纯度（A260/A280）。
第二步：逆转录 (cDNA合成)
使用逆转录试剂盒，将提取的RNA反转录为cDNA。这是PCR的模板。
第三步：反应体系配置 (20 μL体系示例)
在冰上操作，按以下比例混合：
2× qPCR Mix: 10 μL
引物&探针混合液: 1 μL
cDNA模板: 2 μL (或按比例稀释)
无核酸酶水: 补足至20 μL
第四步：上机扩增 (两步法或三步法)
预变性：95℃ 5分钟 (激活Taq酶)。
循环反应 (40-45个循环)：
95℃ 15秒 (变性)
60℃ 30-60秒 (退火及延伸，采集荧光)
第五步：数据分析
Ct值：每个样本会得到一个Ct值（扩增曲线穿过阈值线的循环数）。
相对定量 (2^(-ΔΔCt)法)：
计算 ΔCt = (pNOS Ct值 - 内参基因Ct值)。
计算 ΔΔCt = (处理组ΔCt - 对照组ΔCt)。
计算 2^(-ΔΔCt)，结果表示pNOS基因在处理组相对于对照组的表达倍数变化。
5. 关键注意事项
防污染：
PCR产物极微量即可被扩增，因此必须严格分区操作（试剂准备区、样本制备区、PCR扩增区）。
使用带滤芯的吸头，手套勤更换。
内参基因的重要性：
必须同时检测内参基因（Housekeeping gene），以排除因加样误差或RNA提取效率不同带来的数据偏差。
物种特异性：
请务必确认试剂盒标注的物种。虽然人、小鼠、大鼠的iNOS序列相似，但猪（pNOS）的基因序列有其特殊性，通用型试剂盒可能无法准确检测猪源样本。
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