H5N8 亚型禽流感病毒检测试剂盒
试剂简介：
检测目标： 甲型流感病毒H5亚型的HA基因（血凝素）和/或NA基因（神经氨酸酶）。
注：H5N8是指H5亚型血凝素与N8亚型神经氨酸酶的组合，试剂盒通常会同时检测这两个基因以确保准确性。
产品名称 | H5N8 亚型禽流感病毒检测试剂盒 | 分类 | 荧光PCR |
货号 | XG-P1664 | 用途 | 仅供科研研究实验 |
主要应用：
兽医临床诊断： 检测鸡、鸭、鹅等家禽是否感染H5N8病毒。
疫情监测： 养殖场、活禽市场的例行监测及疫区排查。
科研用途： 病毒分离株鉴定、疫苗效力评价等。
2. 检测原理
该试剂盒主要采用一步法实时荧光定量RT-PCR（TaqMan探针法或SYBR Green染料法）：
双重/多重检测： 试剂盒通常设计为同时检测H5基因、N8基因，部分高级试剂盒还会包含内源性内标（IC）或通用型甲流内参。
荧光信号：
探针法： 使用不同荧光标记（如FAM、VIC）的特异性探针，分别识别H5和N8基因。
染料法： 利用SYBR Green染料结合双链DNA发出荧光，通过熔解曲线分析判断特异性。
结果判读： 仪器实时监测荧光信号增长，根据Ct值（循环阈值）判断样本中病毒载量的高低。
3. 试剂盒组成 (以50次规格为例)
组分名称 规格/体积 保存条件 功能说明
PCR反应液 含引物、探针/dNTPs -20℃避光 核心预混液，已包含扩增所需大部分成分
酶混合液 含逆转录酶、Taq酶 -20℃ 催化逆转录和PCR扩增反应
阳性对照 1管 -20℃ 含H5N8目的基因的质粒或体外转录RNA
阴性对照 1管 4℃或-20℃ 无菌双蒸水或缓冲液
ROX参比染料 (可选) -20℃ 用于校正某些PCR仪（如ABI系列）的孔间差异
4. 样本要求与操作流程
第一步：样本采集
样本类型：
拭子： 咽喉拭子、泄殖腔拭子。
组织： 病死禽的脾脏、肝脏、肺脏、脑组织。
液体： 粪便悬液、气管冲洗液、鸡胚尿囊液。
保存运输： 2-8℃保存，加冰运输，24小时内送检；长期保存需-70℃。
第二步：病毒核酸提取
方法： 使用配套的病毒RNA提取试剂盒（磁珠法或离心柱法）。
关键： 操作需在生物安全柜中进行，防止气溶胶污染。
第三步：PCR反应体系配制
解冻： 将试剂在冰上解冻，振荡混匀并瞬时离心。
配制： 按说明书比例混合PCR反应液、酶混合液和ROX（如需）。
分装： 将混合液分装至PCR八联管或96孔板中。
第四步：加样
向反应管中加入提取好的RNA模板（通常为5-10 μL）。
注意： 阳性对照应最后加入，且需更换枪头，防止污染。
第五步：上机扩增
仪器： ABI 7500、LightCycler 480、Bio-Rad CFX96等。
通道设置： FAM（H5）、VIC/HEX（N8）。
反应程序（参考）：
逆转录：42℃-50℃，10-15分钟。
预变性：95℃，3-5分钟。
PCR循环：95℃ 15秒，60℃ 30-45秒（采集荧光），40-45个循环。
5. 结果判读标准
有效实验判定：
阴性对照： FAM和VIC通道均无Ct值（或Ct值 > 40）。
阳性对照： FAM和VIC通道均有明显的扩增曲线，且Ct值符合说明书要求（通常 ≤ 30）。
样本结果判定：
H5N8阳性： FAM通道（H5）和VIC通道（N8）同时出现典型的S型扩增曲线，且Ct值 ≤ 35。
单一基因阳性： 仅H5或仅N8阳性，通常判定为“非H5N8亚型”或“疑似”，需测序确认。
阴性： FAM和VIC通道均无扩增（Ct值 > 40）。
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