产品介绍：
该试剂盒主要用于检测对虾养殖过程中由特定弧菌（主要是副溶血性弧菌）引起的急性肝胰腺坏死病，该病俗称“偷死病”，死亡率极高。
本试剂盒采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术，能够快速、精准地检测病原菌特有的毒力基因（如*pirvp*基因）。
产品名称 | 急性肝胰腺坏死病（AHPND/EMS）病原核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） | 货号 | AP3552 |
产品分类 | 荧光PCR | 规格 | 50T |
�� 产品核心信息
检测对象：致急性肝胰腺坏死病的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）或其他携带AHPND致病质粒的弧菌。
检测原理：TaqMan荧光探针法。针对AHPND病原特有的毒力基因片段设计特异性引物和FAM标记的探针。
适用仪器：ABI 7500、LightCycler 480、CFX96、Bio-Rad C1000等实时荧光定量PCR仪。
检测样本：对虾肝胰腺组织、鳃、养殖水体、虾苗等。
�� 试剂盒组成（以48T为例）
组分名称 规格 作用说明
qPCR Mix 1.0 mL x 1管 含dNTPs、Mg²⁺、热启动Taq酶、反应缓冲液
Primers & Probe 100 μL x 1管 预混引物和FAM标记的探针
阳性对照 (PC) 50 μL x 1管 含目标基因片段的质粒或菌液DNA
阴性对照 (NC) 50 μL x 1管 无DNA酶水（ddH₂O）
ROX Reference Dye 50 μL x 1管 荧光校正染料（视仪器型号选配）
�� 操作流程详解
1. 样本处理与DNA提取
组织样本：取对虾肝胰腺或鳃组织约20 mg，加入180 μL缓冲液GA（或生理盐水），使用组织研磨器匀浆。
DNA提取：
取200 μL匀浆液，使用细菌基因组DNA提取试剂盒（如离心柱法或磁珠法）进行提取。
洗脱步骤：加入50-100 μL洗脱缓冲液（EB）洗脱DNA。
提取的DNA建议立即使用，或置于-20℃保存（避免反复冻融）。
2. 反应体系配制（冰上操作）
总体系：20 μL（可根据仪器要求调整）。
配制表：
试剂 体积
2x qPCR Mix 10 μL
Primers & Probe 1 μL
模板DNA 2 μL（或5 μL，视浓度而定）
ddH₂O 补足至20 μL
3. PCR扩增程序
两步法扩增程序：
步骤 温度 时间 循环数
预变性 95℃ 5分钟 1 cycle
PCR扩增 95℃ 15秒 40 cycles
60℃ 60秒（采集荧光）
�� 结果判读标准
1. 质控标准（必须满足）
阴性对照 (NC)：FAM通道无扩增曲线（Ct值未定义或≥40）。
阳性对照 (PC)：FAM通道出现典型的"S"型扩增曲线，且Ct值 ≤ 30。
2. 样本判定
阳性 (+)：FAM通道出现明显的"S"型扩增曲线，且 Ct值 ≤ 35。表明样本中含有AHPND病原菌。
可疑 (±)：Ct值在 35-40 之间。建议对该样本进行复检，或重新提取DNA检测。若复测Ct值 < 35则判为阳性。
阴性 (-)：FAM通道无扩增曲线，或Ct值 ≥ 40。
⚠️ 注意事项
防污染：qPCR检测灵敏度极高，极易受气溶胶污染。必须严格分区操作（试剂准备区、样本制备区、扩增区），实验服、手套、移液器需专用。
加样规范：加样时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，防止蒸发导致结果异常。
对照设置：每次检测必须设置阴阳性对照，若对照结果不符合预期，本次实验结果视为无效。
临床意义：检测结果需结合对虾的临床症状（如肝胰腺萎缩、空肠、摄食量下降等）进行综合判断。
生物安全：阳性对照含有病原基因片段，操作时应视为具有潜在生物危害性，废弃物需高压灭菌处理。
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注意事项
防污染操作
需在试剂准备区、样本处理区、扩增区独立操作，使用带滤芯吸头及专用实验服。
阳性对照管理
浓度高达1×10⁸拷贝/μL，需单独存放并避免污染其他试剂。
局限性
仅限科研使用，不可用于临床诊断；
环境样本中可能存在PCR抑制剂，需设置内参对照。
关键字： 急性肝胰腺坏死病 ; AHPND/EMS病原 ;PCR-荧光探针法;核酸检测试剂盒;
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