流行性造血器官坏死病病毒（EHNV）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

产品介绍：

该试剂盒主要用于检测淡水鱼类（如虹鳟、河鲈等）是否感染了流行性造血器官坏死病病毒（Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus, EHNV），这是一种对水产养殖业危害极大的虹彩病毒。

 �� 产品核心信息

检测对象：流行性造血器官坏死病病毒（EHNV），属于虹彩病毒科（Iridoviridae）蛙病毒属（Ranavirus）。

检测原理：实时荧光定量PCR（qPCR），采用TaqMan荧光探针法。试剂盒利用特异性引物和探针靶向EHNV的保守基因序列（如主要衣壳蛋白基因MCP或ATP酶基因）进行扩增。

灵敏度与特异性：

高灵敏度：最低检测限通常可达 1×10³ copies/mL（部分产品甚至可达100-500拷贝/mL），显著高于传统细胞培养法。

高特异性：特异性≥99%，不会与其他常见的鱼类病原（如IHNV、IPNV等）发生交叉反应。

适用样本：病鱼的脾脏、肾脏、肝脏组织匀浆液，或细胞培养物。

�� 产品组成与规格

组分名称  规格示例  说明

qPCR反应液 (2×Premix)  800 μL (管)  预混了dNTPs、缓冲液、Mg²⁺、rox dye等。

EHNV引物/探针混合液  100 μL (管)  针对EHNV保守序列设计，探针标记FAM荧光基团。

酶混合物 (Enzyme Mix)  100 μL (管)  含热启动Taq DNA聚合酶，需-20℃保存。

阳性对照 (Positive Control)  50 μL (管)  含EHNV目标基因片段的质粒DNA（如1×10⁸ copies/μL）。

阴性对照 (Negative Control)  1 mL (管)  无菌双蒸水或TE缓冲液。

内参对照 (可选)  100 μL (管)  针对鱼类β-actin或EF-1α基因，标记HEX/VIC荧光，用于监控样本质量。

�� 操作流程简述

样本采集与处理：

组织样本：取病鱼的脾、肾、肝等造血组织，加入PBS缓冲液进行研磨制成10%匀浆，离心取上清。

保存：若不能立即检测，样本应保存在-80℃或液氮中。

DNA提取：

使用商用基因组DNA提取试剂盒（柱式法或磁珠法）提取样本中的总DNA。

关键点：EHNV是DNA病毒，无需逆转录步骤。

试剂准备与加样：

将反应液、酶液、引物探针在冰上解冻并充分混匀，离心30秒。

按说明书比例配制反应体系（通常为20-25 μL），向反应管中加入提取的DNA模板（通常5-10 μL）。

必须设置：阴性对照（无菌水）和阳性对照（试剂盒提供）。

上机扩增：

将反应管放入荧光定量PCR仪。

推荐程序：

预变性：95℃ 5分钟；

循环反应：95℃ 15秒 → 60℃ 60秒（在此步收集荧光），进行40-45个循环。

结果判读：

阳性（+）：FAM通道扩增曲线呈典型指数增长，且Ct值 < 38-40。

阴性（-）：FAM通道无扩增曲线，或Ct值 ≥ 40。

可疑（±）：Ct值在 38-40 之间，建议重新采样复测。

质控标准：阳性对照Ct值应≤35，阴性对照应无扩增曲线。

⚠️ 注意事项与安全提示

严格分区操作：为防止气溶胶污染导致假阳性，实验必须严格分区（试剂准备区、样本处理区、PCR扩增区），且各区物品专用。

试剂保存：试剂盒需在 -20℃ 条件下避光保存。酶混合物对温度敏感，应避免反复冻融。

宿主范围：EHNV主要感染虹鳟、河鲈等淡水鱼类。在检测时需注意区分其他蛙病毒属成员（如欧洲六须鲇病毒ESV）。

生物安全：EHNV被OIE（世界动物卫生组织）列为法定报告疾病，中国将其列为二类动物疫病。阳性样本需按相关规定进行严格隔离和无害化处理，防止疫情扩散。

水温影响：该病易在 15-20℃ 水温中暴发。在非流行季节或水温过高/过低时，病毒载量可能较低，需结合临床症状综合判断。

公司正在出售的产品：

PCR（聚合酶链式反应）是一种基因扩增技术，

用于检测或定量特定DNA/RNA序列。其核心是通过温度循环（变性、退火、延伸）扩增目标基因片段，而非培养生物体。

关键点：

无需培养：PCR直接检测样本中的核酸，无需预先培养微生物或细胞。

应用场景：病原体检测（如病毒、细菌）、基因表达分析、遗传病诊断等。