牛流行热病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

牛流行热病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

商品属性

预期用途

本试剂盒基于SYBR Green染料法实时荧光RT-PCR技术，用于定性检测牛流行热病毒（BEFV）核酸，适用于临床样本（如血清、组织）的病原学诊断及流行病学监测。

检验原理

通过设计BEFV特异性引物，在反转录酶和DNA聚合酶作用下，对靶标基因进行逆转录和扩增。SYBR Green染料与双链DNA结合后释放荧光信号，通过实时监测荧光强度变化，结合Ct值判定结果。

试剂组成

RT-PCR预混液（含缓冲液、dNTPs、SYBR Green染料）：10 μL/反应

酶混合液（含逆转录酶、热启动Taq DNA聚合酶）：1 μL/反应

阳性对照（灭活BEFV核酸）：1管

阴性对照（无核酸水）：1管

DEPC水：补齐体积用

储存条件及有效期

-20℃避光保存，避免反复冻融（≤5次），有效期12个月。

适用仪器

ABI 7500、LightCycler 480、Bio-Rad CFX96等荧光定量PCR仪。

使用方法

样本处理

核酸提取：采用磁珠法或离心柱法提取样本RNA，溶于20-50 μL DEPC水。

反应体系配制（20 μL/反应）

RT-PCR预混液：10 μL  

上游引物（10 μM）：0.5 μL  

下游引物（10 μM）：0.5 μL  

酶混合液：1 μL  

cDNA模板：2 μL  

DEPC水：补至20 μL  

PCR程序

逆转录：50℃ 15分钟；

预变性：95℃ 1分钟；

扩增：95℃ 15秒 → 55℃ 30秒（采集荧光），40个循环；

熔解曲线分析：95℃ 15秒 → 60℃ 1分钟 → 95℃ 15秒。

结果判定

阳性：Ct值≤35，且熔解曲线出现单一峰值；

可疑：35<Ct值<40，建议重复检测；

阴性：无Ct值或熔解曲线异常。

注意事项

实验分区操作，避免交叉污染；

阳性对照Ct值应在预期范围内，否则实验无效；

不同批号试剂不可混用。

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