人免疫缺陷病毒1型N群染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

人免疫缺陷病毒1型N群染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

商品属性

产品用途

本试剂盒用于体外定性检测人血浆或血清样本中的HIV-1 N群病毒RNA，适用于临床辅助诊断、流行病学监测及疗效评估。

检测原理

RNA提取：样本中病毒RNA通过核酸提取纯化。

逆转录（RT）：提取的RNA逆转录为cDNA。

荧光定量PCR（qPCR）：

采用特异性引物靶向HIV-1 N群保守区域（如pol或gag基因）。

DNA结合染料（如SYBR Green I）嵌入双链DNA，荧光信号随扩增产物累积实时增强。

通过荧光阈值（Ct值）定量病毒载量。

主要组分

| 组分 | 规格（每盒） | 保存条件 |

| RT-PCR预混液（含酶、dNTPs、染料） | 48反应 | -20℃ |

| HIV-1 N群特异性引物混合液 | 48反应 | -20℃ |

| 阳性对照（HIV-1 N群RNA） | 1管 | -70℃ |

| 阴性对照（无RNA酶水） | 1管 | 2~8℃ |

| RNA提取试剂盒（可选配套） | 48样本 | 室温 |

样本要求

样本类型：人血浆或血清（EDTA抗凝）。

采集与保存：

采集后2小时内分离血浆/血清，-70℃保存（避免反复冻融）。

运输：干冰或低温冷链。

操作步骤

1. RNA提取

使用配套或兼容的RNA提取试剂盒，按说明书操作。

2. RT-PCR反应体系配制（以25μL体系为例）

| 组分 | 体积（μL） |

| RT-PCR预混液 | 12.5 |

| 引物混合液 | 2.5 |

| 模板RNA | 5.0 |

| RNase-Free水 | 补足至25 |

3. PCR扩增程序（仪器依赖，参考以下参数）

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |

| 逆转录 | 50℃ | 15~30 min | 1 |

| 预变性 | 95℃ | 3 min | 1 |

| 扩增 | 95℃ | 15 sec | 40 |

| | 60℃ | 45 sec（荧光采集） | |

| 熔解曲线 | 65℃→95℃ | 每0.5℃升/5 sec | 1 |

结果判读

有效性判定：

阳性对照：Ct ≤ 35，熔解曲线单峰。

阴性对照：无扩增曲线（Ct = Undefined）。

样本结果：

阳性：Ct ≤ 38，且熔解曲线峰与阳性对照一致。

阴性：无扩增曲线（Ct = Undefined）。

灰区：38 < Ct ≤ 40，建议重复检测。

性能参数

灵敏度：检出限（LOD）≤ 50 IU/mL（WHO标准品）。

特异性：

不与其他HIV亚型（M/O/P）或常见病原体（HBV、HCV、EBV等）交叉反应。

可区分HIV-1 N群（熔解曲线Tm值：xx±2℃）。

精密度：批内/批间CV ≤ 5%。

注意事项

操作规范

分区操作：试剂配制区、样本处理区、扩增区严格分离。

防污染：使用UDG酶（可选）、一次性耗材及滤芯吸头。

熔解曲线分析必需：排除非特异性扩增。

局限性

仅针对HIV-1 N群设计，不检测其他亚型。

病毒载量低于LOD时可能漏检。

储存及有效期

储存：-20℃避光保存（避免反复冻融）。

有效期：12个月（详见包装标签）。

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