马疱疹病毒4型染料法荧光定量PCR试剂盒
商品属性
产品名称 | 马疱疹病毒4型染料法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Equine Herpesvirus 4 Dye-based qPCR Kit |
规格 | 50T | 货号 | PR4338 |
产品基本信息
| 项目 | 内容 |
| 检测方法 | 实时荧光定量PCR（SYBR Green I染料法） |
| 靶基因区域 | EHV-4 gB基因保守区 |
| 检测样本类型 | 马鼻拭子、全血（EDTA抗凝）、流产组织、脑脊液 |
| 储存条件 | -20℃避光保存（有效期12个月） |
| 适用仪器 | ABI 7500, Bio-Rad CFX96, Roche LightCycler 480等主流qPCR仪 |
检测原理
采用SYBR Green I荧光染料技术，特异性扩增EHV-4的gB基因片段。通过实时监测荧光信号强度，结合标准曲线对病毒核酸进行绝对定量分析（copies/μL），灵敏度可达10 copies/μL。
试剂盒组分（50测试）
| 组分名称 | 体积/数量 | 主要成分 |
| 2× SYBR Green qPCR Master Mix | 1.25 mL | HotStart Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、SYBR Green I染料、稳定剂 |
| EHV-4特异性引物混合液 | 200 μL | 上游引物：5'-CGGACAAACCGTCCTACTC-3'
下游引物：5'-GTAGTCGTCGGTGTCGTTGT-3' |
| EHV-4阳性对照（PC） | 100 μL | 含gB基因重组质粒（10⁶ copies/μL） |
| 无核酸酶水（NFW） | 1 mL | RNase/DNase-free水 |
| NTC阴性对照 | 100 μL | TE缓冲液 |
操作流程
1. 样本前处理
鼻拭子/组织样本：使用病毒DNA提取试剂盒（推荐柱提法）提取核酸
全血样本：需先进行红细胞裂解，再提取白细胞DNA
2. PCR反应体系配制（20 μL体系）
| 组分 | 体积（μL） |
| 2× Master Mix | 10 |
| 引物混合液 | 2 |
| 模板DNA | 5 |
| NFW | 3 |
对照设置：每批实验需包含阳性对照（PC） 和无模板对照（NTC）
3. 扩增程序设置
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |
| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | 关闭 |
| 变性 | 95℃ | 15 sec | | 关闭 |
| 退火 | 60℃ | 30 sec | 40 | 开启 |
| 延伸 | 72℃ | 10 sec | | 关闭 |
| 熔解曲线 | 65℃→95℃ | 0.5℃/sec | 1 | 开启 |
结果判读标准
阳性：
Ct值 ≤ 35.0
熔解曲线单峰（Tm = 85.0±0.5℃）
可疑：
35.0 < Ct值 ≤ 38.0 → 建议重复检测
阴性：
Ct值 > 38.0 或无扩增曲线
NTC无扩增，PC Ct值在预期范围内（20-25）
定量分析：使用标准品梯度稀释（10¹~10⁸ copies/μL）建立标准曲线，R² ≥ 0.99
性能指标
| 参数 | 性能 |
| 灵敏度 | 10 copies/μL |
| 特异性 | 不与EHV-1、EIV、EAV交叉反应 |
| 重复性 | CV < 5%（n=10） |
| 检测限（LoD）| 50 copies/mL样本 |
注意事项
生物安全：
疑似感染样本需在BSL-2实验室处理
废弃反应管需用10%次氯酸钠浸泡后高压灭菌
防污染措施：
核酸提取区、PCR配制区、扩增区严格分区
使用带滤芯吸头及UV灭菌工作台
质量控制：
若NTC出现扩增，本次实验无效
阳性对照Ct值偏移>2.0需排查原因
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