产品原理
本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术。探针5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止延伸。在PCR扩增过程中，Taq酶的5'核酸外切酶活性切割与靶序列结合的探针，使报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。通过实时监测荧光强度变化，实现对起始模板的定量分析。
产品名称 | 牛传染性胸膜肺炎探针法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Bovine Contagious Pleuropneumonia Probe-based Fluorescent Quantitative PCR Kit |
产品规格 | 50T | 产品分类 | 荧光定量PCR |
检测类型 | PCR检测 | 产品货号 | PR4877 |
产品特点
即开即用：用户只需提供样品RNA模板
高灵敏度：优化的引物和探针设计，检测限可达10²拷贝/μL
高特异性：针对牛传染性胸膜肺炎病原体高度保守区设计，无交叉反应
质量控制：提供阳性对照（1×10⁸拷贝/μL），便于区分假阴性结果
稳定可靠：批间差异小，重复性好
试剂盒组成
| 成分 | 规格 | 主要功能 |
| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 500μL | 提供反应体系基础环境 |
| 探针法qRT-PCR酶混合液 | 100μL | 包含逆转录酶和热启动Taq酶 |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL | 用于标准曲线稀释 |
| 特异性引物混合液 | 100μL | 靶向CBPP特异性序列 |
| TaqMan探针 | 50μL | 特异性检测扩增产物 |
| 阳性对照(1×10⁸拷贝/μL) | 50μL | 反应体系质量控制 |
| 产品说明书 | 1份 | 操作指南 |
实验前准备
自备试剂：无RNase水、RNA提取试剂、RNase抑制剂、离心管（0.2mL PCR管）、带滤芯枪头
仪器设备：荧光定量PCR仪、离心机、涡旋振荡器、冰盒、生物安全柜
分区操作：建议在独立区域进行样品制备、试剂配制和PCR扩增
操作步骤
标准曲线制备（10²-10⁷拷贝/μL梯度稀释）
标记6个离心管（2-7号）
每管加入45μL模板稀释液
7号管加入5μL阳性对照（1×10⁸拷贝/μL），震荡混匀得10⁷拷贝/μL
依次进行10倍系列稀释至2号管（10²拷贝/μL）
所有稀释样品置于冰上备用
样品RNA制备
使用商业RNA提取试剂盒或Trizol法提取样品RNA
建议设置N+2个提取（N样品+阳性对照+阴性对照）
RNA溶解于无RNase水中，浓度建议50-200ng/μL
qRT-PCR反应体系配制（20μL体系）
| 组分 | 体积(μL) | 终浓度 |
| qRT-PCR缓冲液 | 10 | 1× |
| 酶混合液 | 2 | - |
| 特异性探针 | 1 | 0.2μM |
| 引物混合液 | 2 | 0.4μM |
| 模板RNA | 5 | - |
| 无RNase水 | 补至20μL | - |
PCR扩增程序
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 逆转录 | 50℃ | 30min | 1 |
| 预变性 | 94℃ | 10min | 1 |
| 变性 | 94℃ | 15sec | 40 |
| 退火/延伸 | 60℃ | 1min | 40 |
| 荧光采集 | 60℃ | - | - |
注：荧光信号在退火/延伸阶段采集（FAM通道）
结果分析
定量分析
以阳性对照log浓度为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线
计算样品RNA浓度：Ct值→log浓度→拷贝数
定性分析
阳性判定：Ct值<35，且有典型扩增曲线
可疑判定：35≤Ct值<40，建议重复检测
阴性判定：Ct值≥40或无扩增
注意事项
本产品仅限科研使用，不可用于临床诊断
操作全程需使用无RNase耗材，防止RNA降解
标准品稀释应在独立区域进行，避免污染
反应体系配制建议在冰上进行
不同仪器可能需要优化反应条件
建议设置复孔以提高结果可靠性
质量控制
阴性对照：Ct值应≥40或无扩增
阳性对照：Ct值应在预期范围内
标准曲线：相关系数R²应≥0.98，效率90-110%
技术参数
检测限：100拷贝/μL
线性范围：10²-10⁷拷贝/μL
批内差异：CV<5%
批间差异：CV<10%
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关键字： 牛传染性胸膜肺炎;染料法荧光定量;PCR试剂盒;