碱性磷酸酶（AKP/ALP）测试盒 新品

碱性磷酸酶（AKP/ALP）测试盒

测定意义与原理

测定意义

碱性磷酸酶（AKP/ALP）是一种广泛分布于生物体内的水解酶，其测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测肝胆疾病（如阻塞性黄疸、急慢性肝炎）、骨骼疾病（如纤维性骨炎、佝偻病、骨软化病等）疾病监测：评估成骨细胞分化状态和骨代谢情况生物学研究：了解细胞分化、肿瘤发生和转移机制农业研究：研究土壤磷素循环和作物磷营养状况工业应用：食品、药品和化妆品质量检测

测定原理

连续监测法（磷酸对硝基苯酚底物法）

ALP催化水解磷酸对硝基苯酚（4-NPP），生成对硝基苯酚（4-NP），在特定波长处监测吸光度变化速率，可计算ALP活性。反应式如下： 4-NPP+H2O→ALP4-NP+Pi4-NPP+H2OALP4-NP+Pi

比色法（磷酸苯二钠底物法）

碱性环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，酚与4-氨基安替比林结合，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物，在特定波长处监测吸光度值，可计算ALP活性。反应式如下： 磷酸苯二钠+H2O→ALP苯酚+Na2HPO4磷酸苯二钠+H2OALP苯酚+Na2HPO4 苯酚+4-氨基安替比林+K3Fe(CN)6→红色醌衍生物苯酚+4-氨基安替比林+K3Fe(CN)6→红色醌衍生物

ELISA法

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验：往预先包被分泌型碱性磷酸酶（SEAP）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的分泌型碱性磷酸酶（SEAP）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成

分光光度法试剂盒（连续监测法）

组分 规格 作用说明

提取液 液体100mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH9.5），用于提取样本中的ALP

试剂一 液体6mL×1瓶 含磷酸对硝基苯酚（4-NPP）溶液，反应底物

试剂二 液体6mL×1瓶 含MgCl₂溶液，激活剂，用于提高ALP活性

试剂三 液体10mL×1瓶 含标准品（ALP），用于建立标准曲线

分光光度法试剂盒（比色法）

组分 规格 作用说明

提取液 液体100mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH10.0），用于提取样本中的ALP

试剂一 液体6mL×1瓶 含磷酸苯二钠溶液，反应底物

试剂二 液体6mL×1瓶 含4-氨基安替比林溶液，显色剂，用于与苯酚反应

试剂三 液体6mL×1瓶 含铁氰化钾溶液，氧化剂，用于氧化苯酚-4-氨基安替比林复合物

试剂四 液体10mL×1瓶 含标准品（ALP），用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预先包被分泌型碱性磷酸酶（SEAP）捕获抗体

酶标试剂 液体6mL×1瓶 含HRP标记的检测抗体，用于检测分泌型碱性磷酸酶（SEAP）

标准品 0.3mL×6管 含分泌型碱性磷酸酶（SEAP）标准品（0、2、4、8、16、32、64U/L）

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法：可见光分光光度计（405nm/660nm检测通道）、1mL玻璃比色皿

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机

通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、电子天平、研钵、分析天平、37℃恒温培养箱

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、甲苯、无水乙醇

样本前处理方法

人血清/血浆样本采集：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激分离：收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离保存：样本贮存2~8℃酶活力可稳定3天；长期保存需-20℃冷冻，避免反复冻融

动植物组织样本取样：称取约0.1-0.2g组织，用生理盐水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行冰浴匀浆离心：12000g 4℃离心30min，取上清液待测保存：若不立即测定，上清液需置于-20℃冷冻保存

细胞样本收集：收集1×10⁶细胞，加入1mL提取液破碎：冰浴超声波破碎（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：12000g 4℃离心30min，取上清液待测

土壤样本取样：称取风干混匀土壤约0.1g预处理：加入50μl甲苯（自备），轻摇15min提取：加400μl提取液并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h终止反应：到时后迅速加入1ml试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应离心：8000g,25℃离心10min，取上清液置于冰上待测

测定操作步骤

分光光度法操作（连续监测法）仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长到405nm，用蒸馏水调零试剂配制：将试剂一、试剂二和试剂三按比例混合，制备工作液工作液预热：工作液在37°C中预热30min以上空白管测定：依次在1ml玻璃比色皿中加入5μl蒸馏水和1000μl预热的工作液，迅速混匀后在405nm测定10s和190s光吸收A1和A2，△A空白管=A2-A1（空白管只需做1-2次）测定管测定：依次在1ml玻璃比色皿中加入5μl上清液和1000μl预热的工作液，迅速混匀后在405nm测定10s和190s光吸收A3和A4，△A测定管=A4-A3结果计算：根据标准曲线计算样品中ALP活性

分光光度法操作（比色法）仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，用蒸馏水调零试剂配制：将试剂一、试剂二和试剂三按比例混合，制备工作液工作液预热：工作液在37°C中预热30min以上标准曲线绘制：将ALP标准品稀释成0、20、40、60、80、100IU/L系列浓度，取100μL标准溶液于比色管中，加入100μL工作液，37℃水浴15min，加入100μL终止液，测定660nm吸光度，绘制标准曲线样品测定：取100μL样品溶液，按标准曲线步骤操作，测定吸光度，根据标准曲线计算样品中ALP活性

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃；设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔；37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟催化生成1μmol产物的酶量

U/L：每升样本每分钟催化生成1μmol产物的酶量

pg/mL：每毫升样本中分泌型碱性磷酸酶的含量（ELISA法）

分光光度法（连续监测法）计算公式

ALP活性(U/L)=ΔA测定管−ΔA空白管Δε×d×V样×106ALP活性(U/L)=Δε×d×V样ΔA测定管−ΔA空白管×106

ΔA测定管：测定管吸光度变化值

ΔA空白管：空白管吸光度变化值

Δε：摩尔消光系数差（L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

V样：样本体积（L）

分光光度法（比色法）计算公式

ALP活性(U/g鲜重)=(A测定−A空白)×C标×V总(A标准−A空白)×WALP活性(U/g鲜重)=(A标准−A空白)×W(A测定−A空白)×C标×V总

A测定：样本管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

C标：标准品浓度（IU/mL）

V总：样本提取液总体积（mL）

W：样本质量（g）

ELISA法计算公式

SEAP含量(pg/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数SEAP含量(pg/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 连续监测法 比色法 ELISA法

线性范围 0~800U/L 0~200U/L 0~64pg/mL

最低检测限 ≤0.1U/L ≤1U/L ≤0.1pg/mL

回收率 90%~110% 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤2.1% CV≤5.0% CV≤10%

批间精密度 CV≤5.0% CV≤8.0% CV≤15%

稳定性 2-8℃保存12个月 2-8℃保存12个月 2-8℃保存6个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免ALP失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

试剂使用：

pNPP溶液需-20℃避光保存，避免分解失效

ELISA法试剂需避免反复冻融，用后立即放回2-8℃保存

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

连续监测法反应温度需严格控制在37℃，反应时间180秒

比色法反应时间需严格控制在15分钟，避免反应过度

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

其他注意事项：

操作时需戴手套和口罩，避免接触皮肤和黏膜

所有试剂和样本需妥善处理，避免污染环境

试剂盒需在有效期内使用，过期试剂请勿使用

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