商品属性
产品名称 | 线粒体呼吸链复合体Ⅰ/NADH辅酶Q还原酶测试盒 | 产品货号 | BH-96116 |
规格 | 100管/96样、25管/24样 | 产品分类 | 辅酶Ⅰ系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
线粒体呼吸链复合体Ⅰ（EC1.6.5.3）又称NADH-CoQ还原酶或NADH脱氢酶，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物：能量代谢核心：催化一对电子从NADH传递给CoQ，是呼吸电子传递链（ETC）的起始环节，为ATP合成提供质子动力活性氧生成源：可使O₂还原生成O₂⁻，是呼吸链产生活性氧（ROS）的主要部位病理生理学价值：酶活性变化可反映线粒体功能状态，与神经退行性疾病、心血管疾病、代谢综合征等密切相关
测定原理
复合体Ⅰ催化NADH脱氢生成NAD⁺，NADH在340nm处有特征光吸收，通过监测340nm处吸光度的下降速率，计算酶活性水平： NADH+H++CoQ→复合体ⅠNAD++CoQH2NADH+H++CoQ复合体ⅠNAD++CoQH2
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计（波长精度±1nm）或酶标仪（具备340nm检测通道）
台式高速离心机（最大转速≥12000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于线粒体样本处理）
必备耗材
1mL石英比色皿（光径1cm）或96孔紫外板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性吸头（无菌无酶）
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（用于样本稀释）
样本前处理方法
血清/血浆样本
直接取上清液检测，无需前处理；若酶活性过高，可用生理盐水稀释后测定
组织/细胞样本（线粒体分离）样本收集：准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10μL试剂三冰浴匀浆：用匀浆器或研钵冰浴匀浆，避免样本升温低速离心：600g 4℃离心5min，弃沉淀（细胞核及细胞碎片）线粒体分离：取上清液11000g 4℃离心10min，沉淀即为线粒体线粒体破碎：沉淀中加入200μL试剂二和2μL试剂三，冰浴超声破碎（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）酶活性测定：取破碎后的线粒体悬液置冰上待测
测定操作步骤
紫外分光光度法操作
分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零
试剂37℃预热15min，按下表加样： | 试剂名称 | 测定管（μL） | 空白管（μL） | | 试剂一 | 700 | 700 | | 试剂二 | 100 | 100 | | 试剂三 | 100 | 100 | | 样本/蒸馏水 | 100 | 100 |
充分混匀后立即记录340nm处初始吸光度A₁和反应1min后的吸光度A₂
计算ΔA = A₁ - A₂，分别记录测定管和空白管的ΔA值
微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：试剂一70μL + 试剂二10μL + 试剂三10μL + 样本10μL充分混匀后立即放入酶标仪，设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每6s读取1次）计算吸光度下降速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/mL：每mL样本每分钟氧化1nmol NADH的酶量
U/mgprot：每mg线粒体蛋白每分钟氧化1nmol NADH的酶量
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟氧化1nmol NADH的酶量
计算公式
复合体Ⅰ活性=ΔA×V反总×V样总ε×d×V样测×T×C复合体Ⅰ活性=ε×d×V样测×T×CΔA×V反总×V样总
ΔA：吸光度变化值（A₁ - A₂）
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
V样测：测定时加入的样本体积（0.1mL）
T：反应时间（1min）
C：样本浓度（蛋白浓度mg/mL、组织鲜重g/mL）
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免反复冻融；若无法立即检测，-80℃可保存1个月
线粒体分离过程需全程冰浴操作，避免酶失活
超声破碎时注意控制功率与时间，避免样本过热
试剂使用：
部分粉剂试剂需临用前配制，现配现用
底物溶液对光敏感，需避光保存；部分试剂具有毒性，避免直接接触
不同批号试剂禁止混用，避免影响检测结果
测定过程：
若ΔA值大于0.5，建议将样本稀释后重新测定
反应温度需严格控制在37℃
正式测定前建议选取2-3个预期差异较大的样本做预测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照与阳性对照
若结果偏差较大，需检查样本处理过程与试剂配制是否正确
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