商品属性
产品名称 | 柠檬酸合酶(CS）测试盒 | 产品货号 | BH-96118 |
规格 | 100管/48样、50管/24样、25管/12样 | 产品分类 | 辅酶Ⅰ系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
柠檬酸合酶（CS，EC2.3.3.1）是三羧酸循环（TCA）起点关键酶，核心功能包括：能量代谢枢纽：催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成柠檬酸，调控TCA循环流量，决定细胞能量代谢速率线粒体功能标记物：仅存在于线粒体基质中，其活性可直接反映线粒体含量与功能状态临床与科研应用：活性异常与心肌损伤、神经退行性疾病、肿瘤代谢重编程、植物抗逆性等密切相关
测定原理
柠檬酸合酶催化乙酰辅酶A与草酰乙酸生成柠檬酸，同时释放CoA-SH；CoA-SH与5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）反应生成黄色产物，412nm处吸光度变化与酶活性成正比。 CoA−SH+DTNB→TNB−+CoA−SS−TNBCoA−SH+DTNB→TNB−+CoA−SS−TNB
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（具备412nm检测通道）
台式高速离心机（最大转速≥12000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于线粒体分离）
必备耗材
1mL石英比色皿/96孔板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性吸头（无菌无酶）
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水
线粒体分离试剂盒（可选，用于高纯度线粒体样本制备）
样本前处理方法
常规组织样本新鲜样本取材后立即液氮速冻，-80℃保存；避免反复冻融称取0.05-0.1g组织，按1:5-10（W/V）比例加入预冷提取液冰浴匀浆（1000-1500rpm，5-10min）8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测；若活性过高可稀释1-5倍
线粒体富集样本称取0.1g组织，加入1mL线粒体分离试剂冰浴匀浆600g 4℃离心5min，弃沉淀；上清液11000g 4℃离心10min沉淀即为线粒体，加入200μL提取液重悬，冰浴超声破碎（功率20%，超声3s/间隔10s，重复20次）12000g 4℃离心10min，取上清液待测
细胞/细菌样本收集1×10^6细胞/细菌，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL提取液重悬，冰浴超声破碎（功率20%，超声3s/间隔10s，重复30次）12000g 4℃离心10min，取上清液待测
测定操作步骤
紫外分光光度法流程
试剂准备：
试剂一（提取液）：直接使用
试剂二（DTNB溶液）：用NaOH溶液配制，浓度0.01mol/L
试剂三（乙酰辅酶A溶液）：用蒸馏水稀释至0.1mmol/L
试剂四（草酰乙酸溶液）：用蒸馏水稀释至0.5mmol/L
预温育：
比色皿中加入：提取液900μL + DTNB溶液50μL + 乙酰辅酶A溶液20μL + 样本20μL
37℃预温育5min，记录初始吸光度A0
反应与测定：
加入草酰乙酸溶液10μL立即混匀，启动反应
连续记录412nm处吸光度变化，读取1min（A1）和2min（A2）时的吸光度
计算ΔA = A2 - A1（吸光度每分钟增加量）
微量法（酶标仪）流程96孔板每孔加入：提取液90μL + DTNB溶液5μL + 乙酰辅酶A溶液2μL + 样本2μL37℃预温育5min，加入草酰乙酸溶液1μL混匀酶标仪设置动力学模式，412nm处连续读取10个循环（每6s读取1次）计算吸光度增加速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/mL：每mL样本每分钟催化生成1nmol CoA-SH的酶量
U/mgprot：每mg组织蛋白每分钟催化生成1nmol CoA-SH的酶量
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟催化生成1nmol CoA-SH的酶量
计算公式
CS活性=ΔA×V反总×V样总ε×d×V样测×T×CCS活性=ε×d×V样测×T×CΔA×V反总×V样总
ΔA：吸光度每分钟增加量
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：TNB摩尔消光系数（13.6×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
V样测：测定时加入的样本体积（0.02mL）
T：反应时间（1min）
C：样本浓度（蛋白浓度mg/mL、组织鲜重g/mL）
简化公式
血清/线粒体样本：CS（U/mL）= 3676 × ΔA
组织样本（蛋白浓度）：CS（U/mgprot）= 3676 × ΔA ÷ Cpr
组织样本（鲜重）：CS（U/g鲜重）= 3676 × ΔA ÷ W
注意事项
样本处理：
柠檬酸合酶对温度敏感，所有操作需在冰浴中进行
线粒体分离过程需严格控制pH值（7.2-7.4），避免酶失活
样本需新鲜制备，-80℃保存不超过1个月
试剂使用：
乙酰辅酶A溶液需现配现用，-20℃分装保存可稳定1周
DTNB溶液对光敏感，配制后需避光保存
草酰乙酸溶液需用NaOH调节pH至7.5，避免自发分解
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）
若ΔA值大于0.3，需将样本稀释后重新测定
空白对照需用提取液替代样本，扣除非酶反应背景
质量控制：
每次实验需设置阳性对照（已知活性的线粒体提取物）
若结果重复性差，需检查试剂配制是否正确或样本是否降解
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