商品属性
产品名称 | 丙酮酸脱羧酶（PDC）测试盒 | 产品货号 | BH-96119 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 辅酶Ⅰ系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
丙酮酸脱羧酶（PDC，EC4.1.1.1）是糖酵解途径关键酶，主要功能包括：能量代谢：催化丙酮酸脱羧生成乙醛，是乙醇发酵途径的核心步骤胁迫响应：参与植物低氧胁迫、干旱胁迫的代谢调控工业应用：用于酿酒、生物燃料生产等发酵工艺的优化病理研究：与神经退行性疾病、代谢紊乱等疾病相关
测定原理
PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛和CO₂，通过偶联NADH氧化反应监测酶活性： 丙酮酸→PDC乙醛+CO2丙酮酸PDC乙醛+CO2 乙醛+NADH+H+→乙醇脱氢酶乙醇+NAD+乙醛+NADH+H+乙醇脱氢酶乙醇+NAD+ NADH在340nm处有特征吸收峰，通过监测吸光度下降速率计算PDC活性。
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）
台式高速离心机（≥12000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于细菌/酵母样本）
必备耗材
1mL石英比色皿（光径1cm）/96孔紫外板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（0.85% NaCl）
液氮（用于样本速冻）
样本前处理方法
植物组织样本取新鲜叶片/根茎组织，用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干水分称取0.1g组织，加入1mL预冷的提取液，冰浴匀浆12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定
酵母/细菌样本收集对数生长期酵母（OD600=0.6-0.8）或细菌（OD600=0.5-0.7）8000g 4℃离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤2次加入1mL预冷提取液重悬，冰浴超声破碎（功率20%，超声3s/间隔10s，重复30次）12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测
昆虫组织样本取新鲜昆虫组织（如脂肪体、中肠），用生理盐水冲洗按1:5比例加入提取液，冰浴匀浆10000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
测定操作步骤
紫外分光光度法操作
试剂配制：
试剂一：提取液，直接使用
试剂二：辅酶溶液，使用前用蒸馏水稀释5倍
试剂三：底物溶液，现配现用，-20℃可保存1周
预温育：
取比色皿，依次加入：提取液920μL + 稀释后辅酶溶液20μL + 样本40μL
37℃预温育5min，记录340nm处初始吸光度A1
反应启动：
加入底物溶液20μL，立即混匀，开始计时
分别记录1min（A2）、2min（A3）时的吸光度值
计算ΔA：ΔA = (A1 - A2) + (A2 - A3)
微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：提取液92μL + 稀释后辅酶溶液2μL + 样本4μL37℃预温育5min，加入底物溶液2μL立即混匀设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每6s读取1次）计算吸光度下降速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟转化1μmol丙酮酸的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分钟转化1μmol丙酮酸的酶量
U/10⁶cell：每100万个细胞每分钟转化1μmol丙酮酸的酶量
计算公式
PDC活性(U/g鲜重)=ΔA×V反总×V样总ε×d×W×T×V样测PDC活性(U/g鲜重)=ε×d×W×T×V样测ΔA×V反总×V样总
ΔA：1min内吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
W：组织鲜重（g）
T：反应时间（1min）
V样测：测定时加入样本体积（0.04mL）
简化公式
组织样本：PDC（U/g鲜重）= 63.5 × ΔA ÷ W
蛋白样本：PDC（U/mgprot）= 63.5 × ΔA ÷ Cpr （Cpr为蛋白浓度，mg/mL）
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月
匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃
避免样本接触金属离子，可用EDTA螯合
试剂使用：
辅酶溶液对光敏感，需避光保存
底物溶液需现配现用，避免分解
试剂配制后需检查pH值（7.5±0.2）
测定过程：
反应温度严格控制在30-37℃，不同样本最适温度不同
若ΔA值大于0.3，需稀释样本后重新测定
每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算
质量控制：
每次实验设置空白对照（提取液替代样本）和阳性对照（已知活性PDC酶）
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确
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