α酮戊二酸脱氢酶（αKGDH）测试盒

α酮戊二酸脱氢酶（αKGDH）测试盒

测定意义与原理

测定意义

α-KGDH（EC1.2.4.2）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。其活性测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测线粒体疾病、神经系统疾病、心血管疾病等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解线粒体功能、细胞凋亡和细胞增殖机制药物研发：筛选线粒体靶向药物，用于治疗线粒体疾病和神经退行性疾病环境监测：评估环境污染对生物线粒体的影响

测定原理

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。反应式如下： α-酮戊二酸+NAD++CoA-SH→α-KGDH琥珀酰CoA+CO2+NADH+H+α-酮戊二酸+NAD++CoA-SHα-KGDH琥珀酰CoA+CO2+NADH+H+

试剂盒组成

紫外分光光度法/微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

试剂一 30mL×1瓶 含提取液，用于提取样本中的α-KGDH

试剂二 20mL×1瓶 含α-酮戊二酸溶液，反应底物

试剂三 1.5mL×1支 含NAD+溶液，反应辅助因子

试剂四 粉剂×1瓶 含辅酶A溶液，反应底物

试剂五 液体20mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH7.4），用于配制工作液

试剂六 液体1.5mL×1支 含标准品（α-KGDH），用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96T/48T 预包被抗α-KGDH抗体的微孔板

标准品 6管/盒 含0、2、4、8、16、32、64U/Lα-KGDH标准品

酶标抗体 6mL/瓶 含HRP标记的抗α-KGDH抗体

样本稀释液 20mL/瓶 用于稀释样本和标准品

洗涤液 250mL/瓶 用于洗涤酶标板

底物A液 6mL/瓶 含过氧化氢溶液，用于显色反应

底物B液 6mL/瓶 含TMB溶液，用于显色反应

终止液 6mL/瓶 含硫酸溶液，用于终止显色反应

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度法：紫外分光光度计、1mL石英比色皿

微量法：酶标仪、96孔板

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、洗板机、恒温箱

通用：台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸

样本前处理方法

动植物组织样本取样：称取约0.1g组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干匀浆：加入1mL试剂一和10μL试剂三，冰浴匀浆低速离心：600g 4℃离心5min，弃沉淀高速离心：11000g 4℃离心10min，弃上清，沉淀为线粒体线粒体裂解：沉淀中加入200μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）检测：取上清液用于α-KGDH活性测定

细胞样本收集：收集500万细胞，加入1mL试剂一和10μL试剂三破碎：超声波破碎（冰浴，功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：11000g 4℃离心10min，取上清液用于检测

血清/血浆样本

血清/血浆：直接测定；若浓度过高，用提取液稀释10-20倍

尿液：离心去除沉淀，取上清液测定；或用提取液稀释10-20倍

测定操作步骤

紫外分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，用蒸馏水调零工作液配制：临用前将试剂四加入18mL试剂五，充分溶解，置于37℃孵育10min样品测定：

取1mL石英比色皿，加入0.9mL工作液和0.1mL样本溶液，迅速混匀

记录340nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1标准曲线绘制：

将标准品稀释成0、10、20、30、40、50U/L系列浓度

同样处理，测定2min内吸光值变化，绘制标准曲线

微量法操作仪器预热：酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm工作液配制：同上样品测定：

取96孔板，加入100μL工作液和10μL样本溶液，迅速混匀

记录340nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1标准曲线绘制：同上

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1μmol NADH的酶量

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟生成1μmol NADH的酶量

U/L：每升样本每分钟生成1μmol NADH的酶量

紫外分光光度法/微量法计算公式

α-KGDH活性(U/mg prot)=(ΔA样本−ΔA空白)×V总Cpr×V样×ε×d×T×106α-KGDH活性(U/mg prot)=Cpr×V样×ε×d×T(ΔA样本−ΔA空白)×V总×106

ΔA样本：样本管吸光度变化值

ΔA空白：空白管吸光度变化值

V总：反应体系总体积（L）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样：样本体积（L）

ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

T：反应时间（min）

ELISA法计算公式

α-KGDH含量(U/L)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数α-KGDH含量(U/L)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 紫外分光光度法 微量法 ELISA法

线性范围 0~50U/L 0~50U/L 0~64U/L

最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.1U/L ≤0.1U/L

回收率 90%~110% 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤5.0% CV≤10%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤8.0% CV≤15%

稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免α-KGDH失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

试剂使用：

工作液临用前配制，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融

试剂含有毒性物质，避免直接用手接触

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定，确保数据准确

比色测定初始读数（0分钟读数）0.4左右为理想状态

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

其他注意事项：

本产品仅供科研研究使用，不得用于人体临床直接检测

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作

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