商品属性
产品名称 | 脂肪酸合成酶（FAS）测试盒 | 产品货号 | BH-961124 |
规格 | 100管/96样、10管/9样、25管/24样、50管/48样 | 产品分类 | 辅酶Ⅱ系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
脂肪酸合成酶（FAS）是生物体内脂肪酸合成的关键酶，主要功能包括：脂肪合成：催化乙酰-CoA和丙二酸单酰-CoA合成脂肪酸能量储存：将多余能量转化为脂肪储存，维持能量平衡信号调节：调控细胞增殖、分化和凋亡疾病关联：FAS过度表达与肥胖、糖尿病、癌症等疾病密切相关药物靶点：FAS抑制剂可用于治疗肥胖、代谢综合征和某些癌症
测定原理
采用紫外分光光度法检测FAS活性，反应式如下： 乙酰-CoA+7丙二酸单酰-CoA+14NADPH+14H+→FAS棕榈酸+7CO2+8CoA+14NADP++6H2O乙酰-CoA+7丙二酸单酰-CoA+14NADPH+14H+FAS棕榈酸+7CO2+8CoA+14NADP++6H2O 通过监测NADPH在340nm处吸光度下降速率计算FAS活性。
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）
台式高速离心机（≥12000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）
必备耗材
1mL石英比色皿/96孔紫外板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（用于样本稀释）
液氮（用于样本速冻）
样本前处理方法
动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取0.1g组织，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定
血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本：加入抗凝剂（肝素/EDTA）后3000g 4℃离心10min，取上清样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释
细胞/细菌样本收集对数生长期细胞/细菌，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL预冷提取液重悬，冰浴超声破碎（功率20%，超声3s/间隔10s，重复30次）12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
测定操作步骤
紫外分光光度法操作
试剂准备：
试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存
试剂二：粉剂×1支，-20℃避光保存，用时加550μL蒸馏水溶解（现配现用）
试剂三：粉剂×1支，-20℃避光保存，用时加550μL蒸馏水溶解（现配现用）
工作液：试剂一900μL + 试剂二50μL + 试剂三50μL，现配现用
预温育：
分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零
工作液置于37℃水浴中预热10min
反应启动：
取比色皿，依次加入：工作液900μL + 样本100μL
混匀，在340nm波长下记录0min（A1）和5min（A2）时的吸光度值
计算ΔA：ΔA = A1 - A2
微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：工作液90μL + 样本10μL37℃预温育5min，加入样本后立即混匀设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度下降速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟氧化1μmol NADPH的酶量
U/mL：每mL样本每分钟氧化1μmol NADPH的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分钟氧化1μmol NADPH的酶量
计算公式
FAS活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×V样总ε×d×Cpr×V样测×TFAS活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样测×TΔA×V反总×V样总
ΔA：5min内吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：NADPH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样测：测定时加入样本体积（0.1mL）
T：反应时间（5min）
简化公式
组织样本：FAS（U/g鲜重）= 0.322 × ΔA ÷ W
液体样本：FAS（U/mL）= 0.322 × ΔA
蛋白样本：FAS（U/mgprot）= 0.322 × ΔA ÷ Cpr
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月
匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃
避免样本接触金属离子，可用EDTA螯合
试剂使用：
试剂二、三需现配现用，-20℃分装保存可稳定1个月
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
工作液需现配现用，避免NADPH氧化
测定过程：
反应温度严格控制在37℃（最适温度）或25℃（其他物种）
若ΔA值大于0.5，需稀释样本后重新测定
每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算
质量控制：
每次实验设置空白对照（提取液替代样本）和阳性对照
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确
实验前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验
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