商品属性
产品名称 | 蔗糖磷酸化酶(SP)测试盒 | 产品货号 | BH-961125 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 辅酶Ⅱ系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
蔗糖磷酸化酶（SP，EC2.4.1.7）是一种重要的糖苷转移酶，主要功能包括：糖苷合成：裂解葡萄糖苷键，催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖等，合成相应的葡萄糖基低聚糖工业应用：催化氢醌合成熊果苷，具有极强的美白效果，在化妆品工业中具有重要应用代谢调节：参与微生物和植物中的碳代谢途径，影响生长发育和环境适应性生物催化：作为生物催化剂用于生物合成和生物转化反应
测定原理
采用偶联酶法检测SP活性，反应过程如下： 蔗糖+磷酸→SP1-磷酸葡萄糖+果糖蔗糖+磷酸SP1-磷酸葡萄糖+果糖 1-磷酸葡萄糖→葡萄糖磷酸变位酶6-磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖葡萄糖磷酸变位酶6-磷酸葡萄糖 6-磷酸葡萄糖+NADP+→6-磷酸葡萄糖脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+6-磷酸葡萄糖+NADP+6-磷酸葡萄糖脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+ NADPH在340nm处有特征吸收峰，通过测定340nm吸光度增加速率，即可计算SP活性。
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）
台式高速离心机（≥8000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）
必备耗材
1mL石英比色皿/96孔板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（0.85% NaCl）
液氮（用于样本速冻）
样本前处理方法
动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取0.1g组织，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定
细菌/细胞样本收集对数生长期细菌/细胞，8000g 4℃离心5min弃上清按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)=500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本：加入抗凝剂（肝素/EDTA）后3000g 4℃离心10min，取上清样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释
测定操作步骤
紫外分光光度法操作
试剂准备：
试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存
试剂二：液体50mL×1瓶，4℃保存
检测工作液：使用前将试剂一与试剂二按1:1比例混合，充分混匀；现配现用
检测工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中预热10min以上
预温育：
分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零
反应启动：
取比色皿，依次加入：工作液1.0mL + 样本0.05mL
混匀，记录340nm波长下0min（A1）和1min（A2）时的吸光度值
计算ΔA：ΔA = A2 - A1
微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：工作液100μL + 样本5μL37℃预温育5min，加入样本后立即混匀设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度增加速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟生成1μmol NADPH的酶量
U/mL：每mL样本每分钟生成1μmol NADPH的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分钟生成1μmol NADPH的酶量
计算公式
SP活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×V样总ε×d×Cpr×V样测×TSP活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样测×TΔA×V反总×V样总
ΔA：1min内吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（1.05mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：NADPH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样测：测定时加入样本体积（0.05mL）
T：反应时间（1min）
简化公式
组织样本：SP（U/g鲜重）= 3.39 × ΔA ÷ W
液体样本：SP（U/mL）= 3.39 × ΔA
蛋白样本：SP（U/mgprot）= 3.39 × ΔA ÷ Cpr
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月
匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃
植物样本需避免光照，防止光合作用影响酶活性
试剂使用：
NADP+溶液对光敏感，配制后需避光保存
检测工作液需现配现用，避免氧化
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）
若ΔA值大于0.3，需稀释样本后重新测定
每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算
质量控制：
每次实验设置空白对照（提取液替代样本）和阳性对照
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确
正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定
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