商品属性
产品名称 | 硫氧还蛋白氧化还原酶（TrxR）测试盒 | 产品货号 | BH-961126 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 辅酶Ⅱ系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
硫氧还蛋白氧化还原酶（TrxR）是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。
测定原理
TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+： NADPH+DTNB→TrxRNADP++TNB+H+NADPH+DTNBTrxRNADP++TNB+H+ TNB在412nm有特征吸收峰，通过测定412nm波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。
自备仪器与试剂
必备仪器
可见分光光度计/酶标仪（412nm检测通道）
低温离心机（≥10000rpm）
可调节移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
冰浴匀浆器/超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）
必备耗材
1ml玻璃比色皿/96孔板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（用于样本稀释）
液氮（用于样本速冻）
样本前处理方法
动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取0.1g组织，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆10000rpm 4℃离心10min，取上清置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定
血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本：加入抗凝剂（肝素/EDTA）后3000g 4℃离心10min，取上清样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释
细菌/真菌样本收集对数生长期细胞/细菌，8000g 4℃离心5min弃上清500万细胞加入1mL试剂一，冰浴超声波破碎（功率300w，超声2s，间隔3s，总时间3min）10000rpm 4℃离心10min，取上清置于冰上待测
测定操作步骤
比色法操作
试剂准备：
试剂一：液体×1瓶，4℃保存
试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5ml蒸馏水溶解
预温育：
分光光度计预热30min，调节波长到412nm，用蒸馏水调零
试剂一在25℃（一般物种）或37℃（哺乳动物）预热30min
反应启动：
空白管：取1ml玻璃比色皿，加入100μl试剂二，100μl试剂三，800μl试剂一，迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A1和A2。△A空白管=A2-A1
测定管：取1ml玻璃比色皿，加入100μl试剂二，100μl试剂三，700μl试剂一，100μl上清液，迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A3和A4。△A测定管=A4-A3
微量法（酶标仪）操作流程96孔板每孔加入：试剂一90μL + 试剂二5μL + 试剂三5μL + 样本2μL37℃预温育5min，加入样本后立即混匀设置动力学模式，412nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度增加速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/mL：每mL样本每分钟生成1μmol TNB的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分钟生成1μmol TNB的酶量
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟生成1μmol TNB的酶量
计算公式
TrxR活性(U/mL)=(ΔA测定管−ΔA空白管)×V反总×V样总ε×d×V样测×TTrxR活性(U/mL)=ε×d×V样测×T(ΔA测定管−ΔA空白管)×V反总×V样总
ΔA：1min内吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：TNB摩尔消光系数（13.6×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
V样测：测定时加入样本体积（0.1mL）
T：反应时间（3min）
简化公式
血清(浆)样本：TrxR（U/mL）= 5.14 × (ΔA测定管-ΔA空白管)
组织样本（蛋白浓度）：TrxR（U/mgprot）= 5.14 × (ΔA测定管-ΔA空白管) ÷ Cpr
组织样本（鲜重）：TrxR（U/g鲜重）= 5.14 × (ΔA测定管-ΔA空白管) ÷ W
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月
匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃
避免样本接触金属离子，可用EDTA螯合
试剂使用：
试剂二对光敏感，配制后需避光保存
试剂三需现配现用，避免降解
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）
若ΔA值大于0.5，需稀释样本后重新测定，提高检测灵敏度
若ΔA值小于0.005，可延长反应时间到5min或10min
质量控制：
每次实验设置空白对照（提取液替代样本）和阳性对照
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确
实验前建议选择2-3个预期差异大的样本做预测定
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