丙酮酸激酶（PK）测试盒
测定意义与原理
测定意义
PK（EC2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义：临床诊断：诊断和监测红细胞丙酮酸激酶缺乏症、非球形红细胞溶血性贫血、心肌损伤等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解细胞内糖酵解途径、细胞凋亡和细胞增殖机制药物研发：筛选降糖药物、抗癌药物等
测定原理
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。反应式如下： 磷酸烯醇式丙酮酸+ADP→PK丙酮酸+ATP磷酸烯醇式丙酮酸+ADPPK丙酮酸+ATP 丙酮酸+NADH+H+→乳酸脱氢酶乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸脱氢酶乳酸+NAD+
试剂盒组成
紫外比色法/微量法试剂盒
组分 规格 作用说明
提取液 60mL×1瓶 用于提取样本中的PK
试剂一 液体45mL×1瓶 含缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境
试剂二 粉剂×1支 含NADH溶液，反应底物
试剂三 粉剂×1支 含磷酸烯醇式丙酮酸，反应底物
试剂四 液体×1支 含辅助因子，反应辅助因子
标准品 1mL×1支 含PK标准液，用于建立标准曲线
ELISA法试剂盒
组分 规格 作用说明
包被板 96孔×1块 预包被抗PK单克隆抗体
酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗PK抗体
标准品 液体1mL×6管 含0.156-10ng/mL PK标准品
样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品
显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液
显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液
终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液
20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外比色法/微量法：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
动植物组织样本取样：称取约0.1g组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干匀浆：加入1mL提取液，冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清检测：上清液用于PK活性测定蛋白浓度测定：用考马斯亮蓝法或BCA法测定样本蛋白浓度
细胞/细菌样本收集：收集500万细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清破碎：加入1mL提取液，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清检测：上清液用于PK活性测定
血清/血浆样本
血清(浆)样品：直接检测
测定操作步骤
紫外比色法/微量法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零试剂配制：
试剂二：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用
试剂三：临用前加入900μL蒸馏充分溶解备用样本测定：
试剂名称(mL) 测定管 对照管
试剂一 1.0 1.0
试剂二 0.05 0.05
试剂三 0.05 0.05
试剂四 0.025 0.025
试剂五 0.05 0.05
混匀后，37℃预温10分钟
测定管加样本0.02mL，对照管加双蒸水0.02mL，快速混匀
波长340nm，0.5cm光径的石英比色皿，双蒸水调零，测定30秒时初始吸光度A1值，然后将比色皿中的反应液倒入预先编号的原试管中，放入37℃水浴箱中准确水浴15分钟，然后取出试管测定15分30秒时的吸光度A2值标准曲线绘制：将PK标准品稀释成0、10、20、30、40、50U/L系列浓度，同样处理，测定15分钟内吸光度变化，绘制标准曲线
ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：
从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃
设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度
结果计算方法
单位定义
U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH的酶量
U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟消耗1nmol NADH的酶量
U/L：每升样本每分钟消耗1nmol NADH的酶量
紫外比色法/微量法计算公式
PK活性(U/mg prot)=(ΔA样本−ΔA空白)×V总Cpr×V样×ε×d×T×109PK活性(U/mg prot)=Cpr×V样×ε×d×T(ΔA样本−ΔA空白)×V总×109
ΔA样本：样本管吸光度变化值
ΔA空白：空白管吸光度变化值
V总：反应体系总体积（L）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样：样本体积（L）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
T：反应时间（min）
ELISA法计算公式
PK含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数PK含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数
性能指标
指标 紫外比色法/微量法 ELISA法
线性范围 0~50U/L 0.156-10ng/mL
最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.05ng/mL
回收率 90%~110% 90%~110%
批内精密度 CV≤5.5% CV≤5.0%
批间精密度 CV≤3.3% CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存3个月有效 2-8℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免PK失活；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活导致PK含量变化
若样本吸光值超出标准曲线范围，需稀释样本后重新测定
试剂使用：
工作液临用前配制，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
底物请避光保存
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）
加入试剂后需充分混匀，确保反应完全
加终止液后应尽快测定吸光度，15分钟内完成
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理
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