商品属性
产品名称 | 二氢黄酮醇还原酶（DFR）测试盒 | 产品货号 | BH-961181 |
规格 | 100管/48样、50管/24样 | 产品分类 | 氧化与抗氧化系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
二氢黄酮醇还原酶（DFR）是类黄酮合成途径中的关键酶，其测定具有重要的实际意义：植物生理学：决定植物花色、叶色、果色等性状的关键因素食品科学：影响水果、蔬菜、茶叶等的色泽和营养品质生物技术：用于植物基因工程和代谢工程研究农业生产：培育高黄酮含量作物和观赏植物新品种医药研究：黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性
测定原理
二氢黄酮醇还原酶作用于二氢槲皮素产生儿茶素，可与香草醛缩合形成红色化合物，在500nm处有最大吸收峰，吸光度与酶活性成正比。反应式如下： 二氢槲皮素+NADPH→DFR儿茶素+NADP++H2O二氢槲皮素+NADPHDFR儿茶素+NADP++H2O
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂一 液体100mL×1瓶 含0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，提供酶促反应环境
试剂二 液体10mL×1瓶 含2mmol/L二氢槲皮素溶液，酶促反应底物
试剂三 液体1.5mL×1瓶 含10mmol/L NADPH溶液，酶促反应辅因子
试剂四 液体25mL×1瓶 含5%香草醛溶液，显色反应试剂
试剂五 液体25mL×1瓶 含浓盐酸，显色反应试剂
标准品 粉剂×1支 含10mg儿茶素标准品，用于建立标准曲线
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度法：可见分光光度计（500nm、340nm检测通道）、1mL玻璃比色皿
微量法：酶标仪（500nm、340nm检测通道）、96孔板
ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板
通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵/组织匀浆器
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液
样本前处理方法
植物组织样本取新鲜植物组织约0.1g，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，冰浴匀浆10000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定
微生物发酵液样本取发酵液10000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定若酶活性过高，用试剂一稀释1-10倍后测定样本可-20℃保存3个月，避免反复冻融
食品样本茶叶：取干燥茶叶0.05g，加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，40℃水浴浸提30min水果/蔬菜：取样本0.1g，加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，冰浴匀浆10000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定
细胞样本收集500万对数生长期细胞，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，冰浴超声波破碎（功率20%或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次）10000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定
测定操作步骤
分光光度法操作
酶促反应：
取比色管，加入样本0.5mL + 试剂二0.2mL + 试剂三0.1mL，混匀
37℃水浴反应30min
空白对照：取样本0.5mL + 试剂一0.3mL，同样处理
显色反应：
向各管加入试剂四0.2mL + 试剂五0.2mL，涡旋混匀，室温静置15min
在500nm波长下测定各管吸光度
ELISA法操作样本处理：将样本稀释至合适浓度（5-160U/mL）加样：取96孔板，加入标准品/样本50μL + HRP标记检测抗体100μL，37℃温育60min洗涤：弃去液体，洗涤5次，每次300μL显色：加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：加入终止液50μL，15min内在450nm波长下测定吸光度
结果计算方法
单位定义
U/g 鲜重：每克植物组织鲜重中DFR酶的活性
U/L：每毫升发酵液/血清中DFR酶的活性
U/mg prot：每毫克蛋白质中DFR酶的活性
计算公式
DFR酶活性(U/g鲜重)=(A样−A空)×C标×V总(A标−A空标)×t×WDFR酶活性(U/g鲜重)=(A标−A空标)×t×W(A样−A空)×C标×V总
A样-A空：样本扣除空白后的吸光度值
C标：标准品浓度（μmol/mL）
V总：样本提取液总体积（mL）
A标-A空标：标准品扣除空白后的吸光度值
t：反应时间（min）
W：样本质量（g）
ELISA法计算绘制标准曲线：以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标计算样本浓度：将样本吸光度代入标准曲线回归方程，计算DFR浓度结果换算：DFR活性（U/L）= 样本浓度（ng/mL）× 换算系数（根据试剂盒说明书）
性能指标
指标 要求
线性范围 0~10μmol/L儿茶素当量，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤0.01U/g鲜重
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶活性失活；-20℃可保存3个月
酶提取液需用pH7.5 Tris-HCl缓冲液，避免过酸或过碱影响酶活性
样本中不能添加重金属离子，以免抑制酶活性
试剂使用：
NADPH溶液需现配现用，避免氧化
香草醛溶液需避光保存，避免分解
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃，反应时间30min
显色反应后需立即测定，2小时后吸光度值会下降
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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