商品属性
产品名称 | 谷氨酸脱氢酶（GDH）测试盒 | 产品货号 | BH-961192 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 氮代谢系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
谷氨酸脱氢酶（GDH，EC 1.4.1.2）是生物体内氨基酸代谢的关键酶，其测定具有重要的生理和病理意义：临床诊断：作为肝功能损害的敏感指标，反映肝细胞损伤程度疾病监测：评估肝硬化、病毒性肝炎、酒精性肝病等疾病进展农业研究：研究植物氮代谢规律，指导合理施肥微生物学：评估微生物发酵过程中的氮素利用效率食品科学：监测食品中的微生物污染和腐败变质
测定原理
采用紫外分光光度法，GDH催化α-酮戊二酸与NH₄⁺反应生成谷氨酸，同时消耗NADH，通过检测340nm波长下NADH的吸光度下降速率反映GDH活性。反应式如下： α-酮戊二酸+NH4++NADH→GDH谷氨酸+NAD++H2Oα-酮戊二酸+NH4++NADHGDH谷氨酸+NAD++H2O
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂一 粉剂×1瓶 含α-酮戊二酸和NADH，需临用前加入10mL蒸馏水溶解
试剂二 液体20mL×1瓶 含0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，提供酶促反应环境
试剂三 液体10mL×1瓶 含氯化铵溶液，酶促反应底物
提取液 液体50mL×1瓶 含0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，用于样本提取
标准品 液体1mL×1支 含100U/L GDH标准品，用于建立标准曲线
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）
低温离心机（≥12000g）
恒温水浴锅/金属浴（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（10-1000μL）
组织匀浆器/研钵
必备耗材
离心管（1.5mL、10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
血清/血浆样本血清样本：室温血液自然凝固10-20分钟后，2000-3000r/min离心20分钟左右，收集上清血浆样本：用EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝，1000×g离心10分钟，取上清直接测定样本保存：样本避免溶血，若不立即使用，-70℃保存避免反复冷冻
动植物组织样本组织处理：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆破碎处理：8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测样本稀释：若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定
细胞/微生物样本细胞收集：收集500万细胞，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎（功率20%或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次）离心处理：12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测微生物处理：按照细菌数量（10⁴个）:提取液体积（mL）=500~1000:1的比例加入提取液，超声波破碎
测定操作步骤
紫外分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零工作液配制：取试剂二10mL + 试剂三0.5mL + 试剂一1瓶，充分溶解混匀，置于37℃水浴5min样本测定：
在微量石英比色皿中加入10μL样本和190μL工作液，混匀
记录340nm处20s时的吸光值A₁和5min20s后的吸光值A₂，计算ΔA=A₁-A₂
空白对照：取10μL提取液替代样本，同样处理
ELISA法操作试剂准备：将所有试剂恢复至室温，洗涤缓冲液用蒸馏水50倍稀释加样：取96孔板，加入标准品/样本50μL + HRP标记检测抗体100μL，37℃温育60min洗涤：弃去液体，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，如此重复洗板5次显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内在450nm波长下测定吸光度
结果计算方法
单位定义
U/mL：每毫升血清（浆）每分钟消耗1nmol NADH的酶量
U/mgprot：每毫克蛋白每分钟消耗1nmol NADH的酶量
U/g：每克组织每分钟消耗1nmol NADH的酶量
U/10⁴cell：每10⁴个细胞每分钟消耗1nmol NADH的酶量
计算公式
GDH活性(U/mL)=ΔA×V反总ε×d×t×V样×109GDH活性(U/mL)=ε×d×t×V样ΔA×V反总×109
ΔA：340nm处吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（L）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
t：反应时间（min）
V样：样本加入体积（L）
简化公式
血清（浆）：GDH(nmol/min/mL) = 643 × ΔA
组织蛋白：GDH(nmol/min/mgprot) = 643 × ΔA ÷ Cpr
细胞/微生物：GDH(nmol/min/10⁴cell) = 2.572 × ΔA
性能指标
指标 要求
线性范围 0~100U/L GDH，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤1U/L
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶活性失活；-20℃可保存3个月
样本避免溶血、脂血、黄疸等异常情况，以免影响检测结果
组织样本需洗净血液并擦干后称重，避免血液干扰
试剂使用：
工作液需现配现用，常温下12h内用完
NADH对光敏感，需避光保存，避免反复冻融
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）
吸光度测定需在5min内完成，避免NADH自动氧化
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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