商品属性
产品名称 | 谷氨酰胺合成酶（GS)测试盒 | 产品货号 | BH-961196 |
规格 | 100管/48样、50管/24样 | 产品分类 | 氮代谢系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
谷氨酰胺合成酶（GS，EC 6.3.1.2）是氮代谢途径中的关键酶，其测定具有重要的生理和应用价值：氮代谢研究：参与氨的同化作用，将氨转化为谷氨酰胺，是氮循环的重要环节植物生理学：研究植物对氮素的吸收和利用效率，指导合理施肥微生物学：评估微生物的氮代谢能力，筛选功能微生物医学研究：与神经系统疾病、肿瘤等疾病的发生发展密切相关环境科学：检测土壤中的GS活性，评估土壤氮素循环能力
测定原理
采用分光光度法，GS催化谷氨酸和ATP反应生成谷氨酰胺和ADP，通过偶联丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶反应，测定NADH的吸光度下降速率反映GS活性。反应式如下： 谷氨酸+NH4++ATP→GS谷氨酰胺+ADP+Pi谷氨酸+NH4++ATPGS谷氨酰胺+ADP+Pi ADP+PEP→PK丙酮酸+ATPADP+PEPPK丙酮酸+ATP 丙酮酸+NADH+H+→LDH乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LDH乳酸+NAD+
试剂盒组成
分光光度法试剂盒
组分 规格 作用说明
试剂一 液体100mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH7.4）、MgCl₂、ATP，提供酶促反应环境
试剂二 液体20mL×1瓶 含谷氨酸钠溶液，酶促反应底物
试剂三 液体20mL×1瓶 含NH₄Cl溶液，酶促反应底物
试剂四 液体10mL×1瓶 含NADH溶液，需临用前加入2mL蒸馏水溶解，-20℃保存
试剂五 液体10mL×1瓶 含丙酮酸激酶（PK）和乳酸脱氢酶（LDH），偶联反应酶
试剂六 液体10mL×1瓶 含PEP溶液，偶联反应底物
提取液 液体100mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH7.4），用于样本提取
标准品 液体1mL×1支 含GS标准品（10U/mL），用于建立标准曲线
ELISA法试剂盒
组分 规格 作用说明
酶标包被板 96T×1盒 已包被GS单克隆抗体，用于捕获样本中的GS
标准品 液体1mL×1瓶 含GS标准品（10ng/mL），用于建立标准曲线
酶标试剂 液体6mL×1瓶 含HRP标记的GS抗体，用于检测结合的GS
显色剂A 液体6mL×1瓶 含底物过氧化氢溶液，用于显色反应
显色剂B 液体6mL×1瓶 含TMB底物，用于显色反应
终止液 液体6mL×1瓶 含硫酸溶液，终止显色反应
浓缩洗涤液 20mL×1瓶 含0.05%吐温20的PBS溶液，用于洗涤
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度法：紫外分光光度计（340nm检测通道）、1mL石英比色皿
ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板
通用：低温离心机（≥12000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵/组织匀浆器
土壤样本：马弗炉、玛瑙研钵
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、甲苯（不允许快递）
样本前处理方法
动植物组织样本新鲜组织：准确称取0.1g植物组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆细胞样本：收集500万细胞，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎（功率20%或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次）离心处理：12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测样本稀释：若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定
土壤样本采样：取5-10g新鲜土样，过2mm筛，去除石块和植物残体提取：称取1g土样，加入5mL提取液，振荡提取30min过滤：用定量滤纸过滤，滤液即为酶提取液，立即测定或-20℃保存
测定操作步骤
分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零工作液配制：按试剂一:试剂二:试剂三:试剂六=5:1:1:1的比例配制工作液样本测定：
在微量石英比色皿中加入10μL样本和190μL工作液，混匀
加入5μL试剂四和5μL试剂五，迅速混匀
记录340nm处20s时的吸光值A₁和5min20s后的吸光值A₂，计算ΔA=A₁-A₂
空白对照：取10μL提取液替代样本，同样处理标准曲线绘制：将GS标准品稀释成0、2、4、6、8、10U/mL系列浓度，同样处理
ELISA法操作试剂平衡：试剂盒从冰箱取出，室温平衡15-30min标准品稀释：将标准品稀释成0、0.25、0.5、1、2、4、8、16ng/mL系列浓度加样：取96孔板，加入标准品/样本50μL + HRP标记检测抗体100μL，37℃温育30min洗涤：弃去液体，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复5次，拍干显色：每孔加入显色剂A、B各50μL，37℃避光孵育10min终止：每孔加入终止液50μL，终止反应（蓝色立转黄色）测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）
结果计算方法
单位定义
U/g 鲜重：每克组织每分钟催化生成1μmol谷氨酰胺的酶量
U/mg 蛋白：每毫克组织蛋白每分钟催化生成1μmol谷氨酰胺的酶量
U/g 干土：每克干土每天催化生成1μmol谷氨酰胺的酶量
分光光度法计算公式
GS酶活性(U/g鲜重)=ΔA×V总×109ε×d×t×mGS酶活性(U/g鲜重)=ε×d×t×mΔA×V总×109
ΔA：340nm处吸光度变化值
V总：反应体系总体积（L）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
t：反应时间（min）
m：样本质量（g）
简化计算
当反应体系为200μL，反应时间5min时： GS酶活性(U/g鲜重)=ΔA×0.0002×1096.22×103×1×5×m=6.43×ΔAmGS酶活性(U/g鲜重)=6.22×103×1×5×mΔA×0.0002×109=m6.43×ΔA
性能指标
指标 要求
线性范围 分光光度法：0~10U/mL；ELISA法：0.25~16ng/mL
最低检测限 分光光度法：≤0.1U/mL；ELISA法：≤0.1ng/mL
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免GS活性失活；-20℃可保存3个月
组织样本需洗净血液并擦干后称重，避免血液干扰
土壤样本需自然风干后磨碎，避免高温和强酸强碱处理
试剂使用：
工作液需现配现用，常温下12h内用完
NADH对光敏感，需避光保存，避免反复冻融
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）条件下进行
吸光度测定需在5min内完成，避免NADH自动氧化
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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