海藻糖合成酶(TS)测试盒
测定意义与原理
测定意义
海藻糖是功能性低聚糖，具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结性等特性，是细胞在不良环境条件下产生的一种重要的抗逆应激物之一，它对生物大分子和生物体组织有着非特异性的保护作用。海藻糖合成酶(TS)催化麦芽糖合成海藻糖，是海藻糖生物合成的关键途径之一。研究其活性对于：植物抗逆研究：了解植物在高温、干旱、高盐等逆境下的适应机制微生物研究：解析微生物抗逆性和生物保护机制生物工程：开发新型抗逆作物和微生物菌株食品工业：利用海藻糖的特性开发新型食品添加剂和保鲜剂
测定原理
TS催化麦芽糖产生海藻糖，使用糖化酶分解剩余麦芽糖为葡萄糖，通过葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量，按照麦芽糖减少的量表示海藻糖合酶活性。反应式如下： 麦芽糖→TS海藻糖麦芽糖TS海藻糖 剩余麦芽糖→糖化酶葡萄糖剩余麦芽糖糖化酶葡萄糖 葡萄糖+O2→葡萄糖氧化酶葡萄糖酸+H2O2葡萄糖+O2葡萄糖氧化酶葡萄糖酸+H2O2 H2O2+底物→过氧化物酶有色产物H2O2+底物过氧化物酶有色产物
试剂盒组成
分光光度法试剂盒
组分 规格 作用说明
试剂一 液体100mL×1瓶,-20℃保存 含提取缓冲液，用于样本裂解与酶提取
试剂二 液体20mL×1瓶,-20℃保存 含反应缓冲液，维持反应体系pH稳定
试剂三 液体1.5mL×1瓶,-20℃保存 含底物麦芽糖，反应底物
试剂四 液体25mL×1瓶,-20℃保存 含糖化酶，用于分解剩余麦芽糖
试剂五 液体10mL×1瓶,-20℃保存 含葡萄糖氧化酶和过氧化物酶，用于葡萄糖定量
试剂六 粉剂×1支,-20℃保存 含显色底物，用于葡萄糖定量；用时加入2mL蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融
标准品 1mL×1支 含麦芽糖标准液
ELISA法试剂盒
组分 规格 作用说明
包被板 96孔/48孔 预包被TS单抗
标准品 1mL×1支 含TS标准液，浓度系列为0、20、40、80、160、320ng/mL
酶标二抗 12mL/6mL×1瓶 辣根过氧化物酶标记的TS多抗
底物溶液 12mL/6mL×1瓶 TMB显色液
终止液 12mL/6mL×1瓶 2M H2SO4，终止显色反应
洗涤液 20×25mL/20×15mL×1瓶 含Tween-20的PBS缓冲液
封闭液 1×20mL/1×10mL×1瓶 含BSA的PBS缓冲液，用于封闭非特异性结合
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度法：分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
ELISA法：酶标仪（450nm波长）、精密移液器、恒温水浴箱、洗板机（可选）
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水
样本前处理方法
动植物组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),冰浴中匀浆。离心：8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
微生物、细胞样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);离心：8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
血清、血浆样本处理：直接检测
测定操作步骤
分光光度法操作仪器预热：分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零;调节水浴锅至37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)。试剂配制：临用将试剂五转移到试剂四中混合溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。样本测定：
试剂名称(μL) 对照管 测定管 标准管
蒸馏水/样本/标准品 100 100 100
试剂二 700 700 700
试剂三 100 100 100
37℃水浴60min后,加入100μL试剂四,混匀,37℃水浴30min后,加入100μL试剂五,混匀,37℃水浴15min,测定340nm处吸光值A,ΔA=A测定-A对照
ELISA法操作试剂准备：将洗涤液用蒸馏水稀释20倍,其他试剂平衡至室温加样：分别设置空白孔、标准孔、样本孔,加入相应溶液孵育：37℃孵育120min,弃去液体,甩干,不用洗涤加检测溶液A：每孔加检测溶液A工作液100μl(在使用一小时内配制),37℃反应60min洗板：弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,大约400μl/每孔,甩干加检测溶液B：每孔加检测溶液B工作液100μl,37℃反应60min洗板：弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干显色：每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色(30分钟内,肉眼可见标准品的3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)终止：每孔加终止溶液50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色测定：用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)
结果计算方法
单位定义
U/g FW：每g组织每分钟催化产生1μmol海藻糖定义为一个酶活力单位。
U/mg prot：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μmol海藻糖定义为一个酶活力单位。
U/mL：每mL血清(浆)每分钟催化产生1μmol海藻糖定义为一个酶活力单位。
计算公式
TS活性(U/g FW)=(A对照−A测定)(A标准−A空白)×C标准×V总W×TTS活性(U/g FW)=(A标准−A空白)(A对照−A测定)×W×TC标准×V总 TS活性(U/mg prot)=(A对照−A测定)(A标准−A空白)×C标准×V总Cpr×TTS活性(U/mg prot)=(A标准−A空白)(A对照−A测定)×Cpr×TC标准×V总
A测定：样本管吸光度值
A对照：对照管吸光度值
A标准：标准管吸光度值
A空白：空白管吸光度值
C标准：标准管浓度，1mg/mL
V总：样本提取液总体积，1ml
W：样本鲜重，g
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml
T：反应时间，60min
性能指标
指标 分光光度法 ELISA法
线性范围 0~100U/mL 20~320ng/mL
最低检测限 ≤1U/mL ≤5ng/mL
回收率 90%~110% 95%~105%
批内精密度 CV≤2.0% CV≤3.0%
批间精密度 CV≤5.0% CV≤6.0%
稳定性 4℃保存6-12个月 4℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
样本需新鲜制备,避免TS失活；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆,避免酶失活
超声波破碎时需控制功率和时间,避免样本降解
试剂使用：
工作液需临用前配制,避免氧化失效
不同批号试剂不能混用,需重新绘制标准曲线
标准品需4℃保存,避免反复冻融
测定过程：
反应时间需严格控制,确保实验结果的一致性
显色后需立即测定,避免颜色褪去
若吸光度值超出线性范围,需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和标准品对照,验证实验体系稳定性
定期校准仪器,确保波长和吸光度准确性
每次实验请使用新的标准品溶液
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