半胱氨酸（Cys）含量测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

半胱氨酸（Cys）是蛋白质中重要的含硫氨基酸，其测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测肝脏疾病、肾脏疾病、营养不良、心血管疾病等疾病监测：评估机体营养状况和疾病严重程度生物学研究：了解蛋白质代谢和氧化应激机制工业应用：监测食品、保健品和化妆品中的Cys含量

测定原理

分光光度法（比色法）

Cys还原磷钨酸生成钨蓝，在600nm处有吸收峰；通过测定600nm吸光度，计算Cys含量。反应式如下： Cys+磷钨酸→酸性条件钨蓝(蓝色)Cys+磷钨酸酸性条件钨蓝(蓝色)

ELISA法

采用双抗体夹心原理，以特异性抗Cys抗体作为捕获抗体，酶标记抗Cys抗体作为检测抗体，通过底物显色反应测定Cys含量。

HPLC法

Cys经衍生化处理后，在高效液相色谱柱上分离，通过紫外检测器或荧光检测器检测，根据保留时间和峰面积定量。

试剂盒组成

分光光度法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体60mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH8.0），用于提取样本中的Cys

试剂一 液体6mL×1瓶 含磷钨酸溶液，反应底物

试剂二 液体6mL×1瓶 含硫酸溶液，酸性显色条件

试剂三 粉剂×1瓶 含抗坏血酸溶液，还原剂，用于还原磷钨酸

试剂四 液体10mL×1瓶 含标准品（Cys），用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗Cys抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗Cys抗体

标准品 液体1mL×2瓶 含0mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L Cys标准品

样本稀释液 液体20mL×1瓶 含PBS缓冲液（pH7.4），用于稀释样本

洗涤液 液体20mL×1瓶 含0.05% Tween-20的PBS缓冲液，用于洗板

底物液 液体10mL×1瓶 含TMB底物液，用于显色反应

终止液 液体10mL×1瓶 含2mol/L H₂SO₄溶液，用于终止显色反应

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法/比色法：可见光分光光度计（600nm检测通道）、1mL玻璃比色皿

微量法：酶标仪（600nm检测通道）、96孔板

HPLC法：高效液相色谱仪、紫外检测器/荧光检测器、C18色谱柱

通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、电子天平

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、85%磷酸、三氯乙酸

样本前处理方法

液体样本（血清/尿液/脑脊液）采集：空腹采集静脉血，分离血清/血浆；收集晨尿或随机尿稀释：取0.1mL液体样品，加试剂一0.9mL，充分混匀离心：8000g 4℃离心10min，取上清液，置冰上待测保存：若不立即测定，上清液需置于4℃冷藏保存

动植物组织样本取样：称取约0.1g组织，用蒸馏水洗净，滤纸吸干，剪碎匀浆：加入1mL提取液，进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清液，置冰上待测稀释：若Cys浓度过高，用提取液稀释1-10倍后测定

微生物/细胞样本收集：收集1×10⁶细胞或1g湿重微生物，加入1mL提取液破碎：冰浴超声波破碎（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清液，置冰上待测

测定操作步骤

分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零试剂配制：临用前将试剂三加入10mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周标准曲线绘制：

取标准品用蒸馏水稀释成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL系列浓度

取100μL标准溶液于EP管中，加入50μL试剂一和50μL试剂二，混匀

室温反应15min，加入100μL试剂三，混匀，室温放置5min

测定600nm波长下的吸光度，绘制标准曲线样品测定：

取100μL样品溶液，按标准曲线步骤操作，测定吸光度

根据标准曲线计算样品中Cys含量

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟加样：每孔加入样本或标准品50μL，37℃孵育30min洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次浸泡3min酶标抗体：每孔加入酶标抗体50μL，37℃孵育30min洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗涤5次，每次浸泡3min显色：每孔加入底物液50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

μmol/mL：每毫升样本中Cys的含量

μmol/g 鲜重：每克鲜重样本中Cys的含量

mg/mL：每毫升样本中Cys的含量（ELISA法）

分光光度法计算公式

Cys含量(μmol/mL)=(A测定−A空白)×C标×V总(A标准−A空白)×V样Cys含量(μmol/mL)=(A标准−A空白)×V样(A测定−A空白)×C标×V总

A测定：样本管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

C标：标准品浓度（μmol/mL）

V总：样本提取液总体积（mL）

V样：样本体积（mL）

ELISA法计算公式

Cys含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数Cys含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

HPLC法计算公式

Cys含量(μmol/g)=样品峰面积×标准品浓度×样品稀释倍数标准品峰面积×样品质量(g)Cys含量(μmol/g)=标准品峰面积×样品质量(g)样品峰面积×标准品浓度×样品稀释倍数

性能指标

指标 分光光度法/比色法 ELISA法 HPLC法

线性范围 0~0.5μmol/mL 0~40mg/mL 0~1000μmol/L

最低检测限 ≤0.01μmol/mL ≤0.1mg/mL ≤0.01μmol/L

回收率 90%~110% 90%~110% 95%~105%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤10% CV≤2.0%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤15% CV≤3.0%

稳定性 2-8℃保存12个月 2-8℃保存6个月 2-8℃保存12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免Cys氧化；-20℃可保存3个月

血清样本需避免溶血，溶血会导致结果偏高

组织样本需冰浴匀浆，避免Cys氧化

若样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测

试剂使用：

粉剂试剂需现用现配，溶解后4℃保存一周

显色剂需临用前配制，避光保存

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

分光光度法反应温度需严格控制在室温，反应时间15分钟

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

若吸光度值超过2，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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