乙酰胆碱酯酶（AchE）测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

乙酰胆碱酯酶（AchE）属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中，在神经传导调节中起重要作用：临床诊断：诊断有机磷农药中毒、肝脏疾病、神经系统疾病等环境监测：评估环境污染程度，尤其是有机磷农药污染生物学研究：了解神经传导机制和神经元功能药物研发：筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂，用于治疗阿尔茨海默病等疾病食品安全检测：检测食品中有机磷农药残留量

测定原理

分光光度法/微量法（Ellman法）

AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412nm吸光度增加速率，计算AchE活性。反应式如下： Acetylthiocholine→AchEThiocholine+Acetic acidAcetylthiocholineAchEThiocholine+Acetic acid Thiocholine+DTNB→TNB(yellow)+DTNB-thiocholine complexThiocholine+DTNB→TNB(yellow)+DTNB-thiocholine complex

ELISA法

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验：预先包被乙酰胆碱酯酶（AchE）捕获抗体的包被微孔中加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体经过温育并彻底洗涤，用底物TMB显色TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色颜色深浅与样品中的乙酰胆碱酯酶（AchE）呈正相关，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)计算样品浓度

试剂盒组成

分光光度法/微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

试剂一 液体1瓶,4℃保存 含缓冲液，用于提取样本中的AchE

试剂二 液体1瓶,4℃避光保存 含乙酰胆碱溶液，AchE反应底物

试剂三 粉剂1瓶,4℃避光保存 含二硫对硝基苯甲酸（DTNB）溶液，显色剂，用于检测AchE活性

试剂四 粉剂1支,4℃保存 含标准品（AchE），用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗AchE单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗AchE抗体

标准品 液体1mL×2瓶 含0、10、20、40、80、160U/L AchE标准品

底物液 液体6mL×1瓶 含TMB底物液，显色反应试剂

终止液 液体6mL×1瓶 含2mol/L H₂SO₄溶液，终止显色反应

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法/微量法：可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机

通用：低温离心机（≥8000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、电子天平

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸

样本前处理方法

动植物组织样本取样：称取约0.1g组织，用蒸馏水洗净，滤纸吸干，剪碎匀浆：按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清液置于冰上待测稀释：若AchE活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定

血清/尿液/血浆样本

血清/血浆：直接测定；若浓度过高，用提取液稀释10-20倍

尿液：离心去除沉淀，取上清液测定；或用提取液稀释10-20倍

细菌/真菌/细胞样本收集：收集1×10⁶细胞，加入1mL提取液破碎：冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）离心：8000g 4℃离心10min，取上清置于冰上待测

测定操作步骤

分光光度法/微量法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412nm，蒸馏水调零。试剂二置于37℃水浴中预热30min标准曲线绘制：

将标准品稀释成0、20、40、60、80、100U/L系列浓度

取微量石英比色皿/96孔板，依次加入20μL标准溶液、160μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀

于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A₁，第190s吸光值记为A₂，计算ΔA=A₂-A₁

以ΔA为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线样品测定：

取20μL样本溶液，按标准曲线步骤操作，测定吸光度变化值ΔA

根据标准曲线计算样品中AchE活性

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/g 鲜重：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量

U/mgprot：每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量

U/L：每升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量

分光光度法计算公式

AchE酶活(nmol/min/mgprot)=ΔA×V反总×109S×d×Cpr×V样×T=245×ΔACprAchE酶活(nmol/min/mgprot)=S×d×Cpr×V样×TΔA×V反总×109=Cpr245×ΔA

ΔA：3min内吸光度变化值（A₂-A₁）

S：TNB摩尔消光系数，13.6×10³ L/mol/cm

d：比色皿光径，1cm

V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10⁻⁴L

Cpr：蛋白浓度（mg/mL）

V样：加入上清液体积（mL），0.02mL

T：反应时间（min），3min

ELISA法计算公式

AchE含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数AchE含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 分光光度法/微量法 ELISA法 HPLC法

线性范围 0~100U/L 0~160U/L 0~1000U/L

最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.01U/L ≤0.001U/L

回收率 90%~110% 95%~105% 98%~102%

批内精密度 CV≤1.5% CV≤3.0% CV≤2.0%

批间精密度 CV≤5.0% CV≤5.0% CV≤3.0%

稳定性 2-8℃保存6个月 2-8℃保存12个月 2-8℃保存12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免AchE失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免AchE失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

试剂使用：

DTNB溶液需避光保存，避免分解失效

ELISA法试剂需避免反复冻融，用后立即放回2-8℃保存

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

分光光度法反应需严格控制温度和时间，确保反应完全

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

公司正在出售的产品