检验原理：
H7N9 禽流感病毒自 2013 年发现以来，已从最初的低致病性毒株（LPAI）演变为高致病性毒株（HPAI-H7）。针对这一变异株的核酸检测试剂盒，主要用于区分和检测具有高致病性特征的 H7N9 病毒。
产品名称 | 禽流感病毒 H7N9 变异株( HPAI-H7)核酸检测试剂盒 | 货号 | AP3008 |
产品分类 | 荧光PCR | 规格 | 50T |
H7N9 变异株背景与检测意义
变异特征：早期的 H7N9 主要表现为低致病性，主要感染禽类的呼吸道。然而，自 2016 年底以来，H7N9 病毒 HA 基因裂解位点发生了插入突变（如多碱性氨基酸插入），使其获得了高致病性禽流感病毒（HPAI）的特征。这种变异株在禽类中致死率极高，且对人类的威胁也相应增加。
检测目的：该试剂盒不仅用于检测 H7N9 病毒的存在，更侧重于鉴别高致病性变异株。这对于禽类疫情的快速处置（如扑杀范围的划定）和人类感染的临床预后评估具有关键意义。
试剂盒核心原理
针对 HPAI-H7 的检测试剂盒通常采用 Real-Time Fluorescent RT-PCR（实时荧光反转录聚合酶链式反应） 技术。
双重靶向设计：
通用筛查：通常会设置针对甲型流感病毒的通用引物/探针（靶向 M 基因），用于确认样本中是否存在甲型流感病毒。
亚型鉴定：针对 H7N9 病毒的 HA 基因（H7 亚型）和 NA 基因（N9 亚型）设计特异性引物和探针。
高致病性鉴别：部分高级试剂盒会专门针对 HA 基因裂解位点附近的突变序列设计探针，以直接区分高致病性（HPAI）和低致病性（LPAI）毒株；或者通过检测 HA 基因的全长或特定片段长度来判断是否存在插入突变。
内标监控：试剂盒通常包含内标（Internal Control, IC），用于监控样本采集、核酸提取和扩增全过程，防止因操作失误或抑制物存在导致的假阴性结果。
�� 典型试剂盒参数
参数项 指标/说明
检测名称 高致病性 H7N9 禽流感病毒核酸检测试剂盒 (荧光 PCR 法)
检测靶标 HA 基因 (H7 亚型), NA 基因 (N9 亚型), M 基因 (甲型流感通用)
检测方法 一步法/两步法 实时荧光 RT-PCR
检测范围 人、禽类（鸡、鸭等）、环境样本（如活禽市场污水、笼具拭子）
灵敏度 最低检测限通常可达 10² - 10³ 拷贝/mL，或 0.04 TCID₅₀
特异性 仅特异性扩增 H7N9 病毒，与其他亚型流感病毒（如 H5N1, H1N1, H3N2）无交叉反应
检测时间 约 2 - 3 小时（含核酸提取）
储存条件 -20℃ ± 5℃ 避光保存（部分酶制剂需单独保存）
�� 样本采集与处理要点
样本类型：
人源：鼻咽拭子、咽拭子、痰液、气管吸取物、肺泡灌洗液（下呼吸道样本检出率更高）。
禽源/环境：泄殖腔拭子、咽喉拭子、禽类组织（如脾、肺、气管）研磨液、环境涂抹样本。
采集时机：发病早期（前 3 天）采样检出率最高。若患者已使用抗病毒药物，可能影响检出率。
运输保存：样本需置于病毒采样管中，4℃ 保存运输，24 小时内送检。若需长期保存，应置于 -70℃ 冰箱，避免反复冻融。
�� 结果判读
阳性：FAM/HEX/VIC 等荧光通道出现典型的 S 型扩增曲线，且 Ct 值小于设定的阈值（如 Ct ≤ 38 或 40），同时内标正常扩增。提示样本中存在 H7N9 禽流感病毒核酸。
阴性：检测通道无扩增曲线，或 Ct 值大于阈值，但内标正常扩增。提示样本中未检测到 H7N9 病毒核酸。
无效：阳性对照未扩增，或阴性对照出现扩增，提示实验失败或试剂污染，需重新检测。
⚠️ 注意事项与局限性
生物安全：H7N9 病毒（特别是高致病性变异株）属于高致病性病原微生物，所有操作必须在 BSL-2 或 BSL-3 实验室中进行，并穿戴 N95 口罩、护目镜和防护服。
假阴性风险：核酸降解、采样不当或扩增抑制物的存在均可能导致假阴性。若临床高度疑似，建议重复采样或结合病毒分离培养进行确认。
临床意义：核酸检测阳性仅表明样本中存在病毒核酸，不代表一定存在活病毒。确诊感染需结合流行病学史、临床症状、影像学检查及抗体滴度变化（双份血清）综合判断。
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操作步骤：
整个流程遵循“样本处理 → 试剂配制 → 加样 → 上机检测 → 结果分析”的逻辑，核心是防污染和精准操作。
1. 样本处理 (核酸提取)
样本：鼻咽拭子、咽拭子或痰液样本。
裂解：将拭子浸入裂解液，充分混匀后室温静置10分钟。
提取：采用磁珠法或离心柱法提取总RNA，严格按照试剂盒说明书操作。
保存：洗脱后的RNA应立即使用或分装保存于-80℃。
2. 试剂配制与加样
反应体系准备：在试剂准备区配制Master Mix。根据待检测样本数计算总体积，通常按样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照的原则来配制。
推荐体系：例如，使用20μL体系的试剂盒，可包含qPCR预混液16μL、引物探针混合液4μL（具体体积请以实际说明书为准）。
分装：将配好的反应体系分装至PCR反应管中（如20μL/管）。
加样：在样本处理区，分别向反应管中加入5μL的模板RNA（样本、阳性质控、阴性质控）。盖紧管盖，短暂离心，避免污染和气泡。
3. 上机检测
运行程序：将反应管放入荧光定量PCR仪，运行预设程序。典型程序包括：
逆转录：50℃，15分钟（将RNA逆转录为cDNA）。
预变性：95℃，10分钟（激活Hot-Start Taq酶）。
扩增循环：通常为40个循环，每个循环包括变性（95℃，15秒） 和 退火/延伸（60℃，45秒），仪器在退火/延伸步骤同时采集荧光信号。
信号监测：仪器实时监测荧光信号变化，生成扩增曲线。
4. 结果分析与判定
Ct值：仪器根据荧光曲线自动计算阈值循环数（Ct值）。
结果判定：
阳性：样本Ct值 ≤ 37（具体阈值请以试剂盒说明书为准），且扩增曲线呈典型"S"型。
阴性：样本无Ct值或Ct值 > 40。
无效：阳性对照无Ct值或Ct值 > 35，或阴性对照有Ct值，需重新检测。
关键字： 禽流感病毒; H7N9 变异株;检测试剂盒;
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