磷酸化丝裂原活化蛋白激酶MKK3/6抗体
原理特点
MKK3/6磷酸化活化是p38 MAPK通路的上游激活激酶，介导炎症、应激信号传导。该抗体特异性识别其磷酸化形式，检测通路上游活化水平；阻断激酶功能可从上游抑制p38炎症应激通路。
英文名称:phospho-MKK3(Ser218) + MKK6(Ser207) Rabbit pAb
中文名称:磷酸化丝裂原活化蛋白激酶MKK3/6抗体
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Optimal working dilutions must be determined by the end user.
英文别名:MKK3(phospho-Ser218); MAP Kinase Kinase 3; Dual specificity mitogen activated protein kinase kinase 3; ERK kinase 3; MAP kinase kinase 3; MAP2K 3; MAPK ERK kinase 3; MAPK kinase 3; MAPKK 3; MAPKK3; MEK 3; MEK3; Mitogen activated protein kinase kinase 3; MKK 3; MKK3; mMKK 3b; mMKK3b; MPK 3; PRKMK 3; PRKMK3; Protein kinase mitogen activated kinase 3; SKK2; zMKK 3; MP2K3_HUMAN; MP2K6_HUMAN
交叉反应:Human,Mouse,Rat
抗体来源:Rabbit
免疫原:KLH conjugated synthesised phosphopeptide derived from human MKK3 around the phosphorylation site of Ser218
亚型:IgG
性状:Liquid
纯化方法:affinity purified by Protein A
克隆类型:Polyclonal
理论分子量：39 kDa
浓度：1mg/ml
储存液：0.01M TBS (pH7.4) with 1% BSA, 0.02% Proclin300 and 50% Glycerol.
保存条件：Shipped at 4℃. Store at -20℃ for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles.
注意事项：This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications.
靶点背景
靶点背景：MKK3、MKK6 是 p38 MAPK 上游专属激酶，双者磷酸化后专一激活 p38，介导炎症、应激、凋亡信号。
抗体原理：MKK3/6 同源磷酸化位点肽免疫，同步识别两种活化上游激酶，区分非磷酸化 MKK3/6。
产品特点：可一步检测 p38 通路上游激活开关，常用于炎症因子刺激、氧化应激损伤通路上下游联动分析。
样本处理与实验操作
1. Western Blot（免疫印迹）
样本制备
细胞样本：PBS洗涤2-3次，加入RIPA裂解液（含1% PMSF和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30分钟，12000rpm离心15分钟取上清，BCA法定量蛋白浓度
组织样本：液氮研磨成粉末，加入裂解液冰上裂解，离心后取上清，调整蛋白浓度至一致
变性处理：加入5×SDS上样缓冲液，95℃加热5-10分钟，冷却后上样
抗体孵育
转膜完成后，用5% BSA或牛奶封闭液室温封闭1-2小时
一抗稀释后4℃孵育过夜（12-16小时），或室温孵育1-2小时；孵育时保证膜完全浸没在抗体溶液中
TBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟；加入二抗（1:5000-1:10000稀释）室温孵育1-2小时
再次洗涤后，用ECL发光液显影，通过凝胶成像系统采集图像
2. IHC-P（石蜡切片免疫组化）
样本前处理
脱蜡水化：依次放入二甲苯（2次，每次10分钟）、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇（各5分钟），最后用PBS冲洗
抗原修复：将切片放入柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，微波炉加热至沸腾，保持10-15分钟，自然冷却至室温
封闭处理：3% H₂O₂室温孵育10分钟灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗后用10%山羊血清封闭30分钟
抗体孵育
一抗稀释后滴加在切片上，4℃孵育过夜；孵育时置于湿盒中，防止液体挥发
次日室温复温30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟；加入二抗（生物素标记）室温孵育30分钟
PBS冲洗后，加入ABC复合物室温孵育30分钟，DAB显色剂显色（显微镜下观察控制时间，通常3-10分钟），苏木素复染后脱水封片
3. ICC/IF（细胞免疫荧光）
样本制备
细胞爬片培养至70-80%汇合度，PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定15-20分钟
通透处理（根据抗体类型选择）：0.1% Triton X-100室温孵育10分钟，PBS冲洗3次
封闭处理：5% BSA室温封闭30-60分钟，减少非特异性结合
抗体孵育
一抗稀释后滴加在爬片上，4℃孵育过夜，或室温孵育1-2小时
PBS冲洗3次，每次5分钟；加入荧光标记二抗（1:200-1:500稀释），室温避光孵育30-60分钟
再次冲洗后，用抗淬灭封片液封片，荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察采集图像
4. ELISA（酶联免疫吸附试验）
包被与封闭
用包被缓冲液（如碳酸盐缓冲液pH9.6）稀释抗原至合适浓度，每孔加入100μl，4℃包被过夜
弃去包被液，PBST洗涤3次，每次3分钟；加入封闭液（5% BSA）每孔200μl，37℃孵育1-2小时
抗体孵育
一抗按比例稀释后，每孔加入100μl，37℃孵育1-2小时，或4℃孵育过夜
PBST洗涤3次，加入稀释好的酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育1小时
洗涤后加入底物溶液（如TMB）每孔100μl，37℃避光显色10-20分钟，加入终止液（2M H₂SO₄），用酶标仪在450nm波长读取OD值
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