大鼠酪氨酸3/色氨酸5单加氧酶活化蛋白θ(YWHAq)重组蛋白适用于 14-3-3 蛋白互作筛选、激酶信号调控、细胞周期及凋亡通路分子机制研究实验。
型号：YS-DB2020
产品名称：大鼠酪氨酸3/色氨酸5单加氧酶活化蛋白θ(YWHAq)重组蛋白
物种：Homo sapiens (Human，人), Mus musculus (Mouse，小鼠), Rattus norvegicus (Rat，大鼠)
英文名称：Recombinant Tyrosine 3/Tryptophan 5 Monooxygenase Activation Protein Theta (YWHAq)
HS1; 14-3-3; 1C5; Protein HS1; 14-3-3 protein T-cell; 14-3-3 protein tau
酶与激酶
物种：Homo sapiens (Human，人), Mus musculus (Mouse，小鼠), Rattus norvegicus (Rat，大鼠)
来源：原核表达
宿主E.coli
内毒素水平：<1.0EU/μg(LAL法测定)
亚细胞定位：：n/a
预测分子量：-
实际分子量：-(差异分析请参阅说明书)
片段与标签：N-terminal His Tag
缓冲液成份：磷酸盐缓冲液（pH7.4，含有 0.01% SKL, 1mM DTT, 5% Trehalose和Proclin300.）
性状：冻干粉
纯度：> 97%
等电点：-
应用：Positive Control; Immunogen; SDS-PAGE; WB.
规格：10μg、50μg、200μg、1mg、5mg
检测原理：
SDS-PAGE 纯度分析：电泳分离蛋白，染色统计主条带纯度，判断杂蛋白与蛋白降解。
BCA 比色定量：蛋白还原二价铜显色，吸光度线性定量重组蛋白浓度。
WB 特异性鉴定：YWHAq 特异性抗体特异性结合重组蛋白，验证蛋白表达无误。
蛋白互作结合活性检测：体外结合磷酸化靶蛋白，免疫共沉淀验证结合能力，表征分子伴侣生物学功能。
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使用方法：
1. 蛋白复溶
解冻：从低温冰箱取出蛋白后，立即置于冰上缓慢解冻，避免室温放置导致蛋白变性。
缓冲液选择：根据蛋白特性选择合适的复溶缓冲液，常用基础缓冲液为10-50mM Tris-HCl（pH7.0-8.0）或PBS（pH7.2-7.4）；部分蛋白需添加100-300mM NaCl维持渗透压，或添加1-5mM DTT、β-巯基乙醇等还原剂保持蛋白稳定性。
复溶操作：根据蛋白浓度，加入适量缓冲液使终浓度达到0.1-1.0mg/mL（部分难溶蛋白可适当调整浓度）；轻轻颠倒离心管或用移液器缓慢吹打混匀，避免剧烈震荡；置于冰上静置10-30分钟，期间可轻柔混匀2-3次，确保蛋白充分溶解。
2. 活性测定（以酶类蛋白为例）
试剂准备：根据酶的催化特性，配制相应的底物溶液、辅助因子溶液、反应缓冲液等；确保所有试剂均为分析纯以上级别，且在有效期内。
反应体系优化：通过预实验确定酶的最适反应温度、pH值、底物浓度、酶浓度等参数；通常反应体系体积为50-200μL，酶浓度需根据活性高低调整。
检测操作：按照优化后的反应体系依次加入试剂，启动反应后，通过分光光度法、荧光法、比色法等检测方法，实时或终点检测底物消耗、产物生成的信号变化。
活性计算：根据检测到的信号变化值，结合摩尔消光系数、荧光量子产率等参数，计算酶的活性单位（U）；1U定义为在特定条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物的酶量。
3. Western Blot检测
样品处理：取适量复溶后的蛋白溶液，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水浴加热5-10分钟使蛋白变性；若蛋白含二硫键，可添加β-巯基乙醇或DTT辅助变性。
电泳分离：将变性后的样品加入SDS-PAGE凝胶的上样孔，同时加入蛋白Marker；先以80V电压运行浓缩胶（约30分钟），待样品进入分离胶后，调整电压至120V继续电泳（约60-90分钟），直至蛋白Marker分离清晰。
转膜操作：根据蛋白分子量选择合适孔径的PVDF或NC膜；采用湿转或半干转法将凝胶中的蛋白转移至膜上，湿转条件通常为200-300mA电流，转膜时间60-120分钟；转膜后可通过丽春红染色确认转膜效果。
封闭与孵育：用5%脱脂牛奶或BSA溶液封闭膜1-2小时，封闭非特异性结合位点；加入一抗（按说明书推荐比例稀释），4℃孵育过夜；次日用TBST缓冲液洗膜3次，每次10分钟；加入HRP标记的二抗（按说明书推荐比例稀释），室温孵育1小时；再次用TBST缓冲液洗膜3次，每次10分钟。
显色检测：将膜浸入ECL化学发光试剂中，避光孵育1-5分钟；使用化学发光成像系统曝光检测蛋白条带，根据条带位置和灰度分析蛋白表达情况。
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