体外泛素化实验技术服务

体外泛素化实验服务 – E3连接酶-底物关系验证 / 泛素化位点鉴定 / 去泛素化酶(DUB)活性检测

体外泛素化实验（In Vitro Ubiquitination Assay） 是研究泛素-蛋白酶体系统及蛋白泛素化修饰的核心体外检测技术，广泛应用于E3泛素连接酶与底物关系验证、泛素化位点鉴定、去泛素化酶（DUB）活性评价及泛素化机制解析等研究领域。本公司提供从泛素相关蛋白表达纯化、体外泛素化/去泛素化反应体系构建、泛素化检测（Western Blot/质谱）到泛素化位点质谱鉴定的全流程一站式体外泛素化实验服务，助力客户精准解析蛋白泛素化修饰的调控机制与生物学功能。

服务技术原理

蛋白泛素化是一种动态、可逆的翻译后修饰，通过泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2） 和泛素连接酶（E3） 的级联反应，将泛素（Ubiquitin） 共价连接到底物蛋白的赖氨酸残基上。去泛素化则由去泛素化酶（DUB） 催化，去除底物上的泛素修饰。

体外泛素化实验是在体外模拟这一生化过程：将纯化的E1、E2、E3酶与底物蛋白及泛素在含有ATP的适宜缓冲体系中共同孵育，通过检测底物蛋白上泛素链的形成情况来评估E3连接酶对底物的泛素化活性。该反应体系完全排除细胞内的复杂背景，能够直接验证E3与底物之间的泛素化关系。反应结束后，产物通过SDS-PAGE分离，利用泛素抗体或底物蛋白特异性抗体进行Western Blot检测，可清晰观察到底物泛素化产生的典型“条带拖尾”或高分子量条带。如需精确定位泛素化修饰位点，则可结合质谱（LC-MS/MS） 进行分析。

去泛素化实验则在体外泛素化反应制备的泛素化底物的基础上，加入纯化的DUB或免疫沉淀获得的内源DUB复合物，通过监测底物泛素化信号的减弱来评价去泛素化酶活性。

主要服务内容

泛素化相关蛋白表达纯化：根据客户需求提供E1、E2（UbcH5b、UbcH7等）、E3连接酶（含RING、HECT、RBR家族）、野生型泛素及泛素突变体（如K48-only、K63-only、K0）的重组蛋白表达与纯化服务；支持客户提供纯化蛋白或基因信息；

体外泛素化反应体系建立与优化：根据E3连接酶-底物组合特性，优化反应缓冲液（pH、离子强度、ATP浓度、Mg²⁺/DTT等）、酶配比（E1:E2:E3梯度优化）及反应时间等关键参数；

体外泛素化反应（单轮或多轮）：

单轮泛素化：使用泛素突变体（如K0）仅进行单泛素修饰，避免泛素链延伸，便于检测单泛素化状态；

多轮泛素化：使用野生型泛素进行多聚泛素链形成，模拟体内多泛素化修饰（K48/K63等连接类型）；

泛素化检测与分析：

Western Blot检测：使用泛素抗体（FK2、P4D1等）或底物蛋白特异性抗体检测底物泛素化信号，呈现特征性“条带拖尾”或高分子量条带；

质谱（LC-MS/MS）泛素化位点鉴定：将泛素化产物酶解后富集，经LC-MS/MS鉴定底物上具体的泛素化修饰位点及泛素链连接类型；

去泛素化实验（DUB活性检测） ：将纯化或免疫沉淀获得的DUB与泛素化底物共孵育，通过Western Blot检测泛素化信号的减弱，评价DUB的切割活性与特异性；

对照实验体系：设置无ATP对照组（验证ATP依赖性）、无E3对照组（排除E2自泛素化背景）、热失活E3对照组（验证E3活性依赖性），确保结果特异性。

典型应用场景

E3泛素连接酶-底物关系验证：直接验证候选E3连接酶是否能够介导目标底物的泛素化，是泛素化机制研究的核心验证手段；

泛素化类型与连接方式鉴定：利用泛素突变体（K48-only、K63-only）或连接特异性抗体，明确泛素链的连接类型（K48-泛素化/降解信号 vs K63-泛素化/信号转导信号）；

泛素化关键赖氨酸位点鉴定：结合底物赖氨酸点突变与质谱鉴定，精确定位介导泛素化修饰的关键位点；

去泛素化酶（DUB）活性检测与底物筛选：评价特定DUB对泛素化底物的切割效率与特异性；

泛素-蛋白酶体通路机制研究：解析蛋白降解、细胞周期、DNA损伤修复、免疫应答等生理过程中的泛素化调控机制；

疾病相关泛素化异常研究：比较正常与肿瘤、神经退行性疾病等病理状态下的泛素化水平差异；

E3/DUB抑制剂筛选：评估小分子化合物对E3连接酶或DUB活性的抑制效果，用于药物早期筛选。

服务优势（为什么选择我们）

反应体系完全可控：可精准调控E1/E2/E3酶配比、ATP浓度、反应时间等参数，排除细胞复杂背景干扰，结果特异性强、重复性高；

直接验证，规避间接调控：体外反应可直接验证E3连接酶对底物的直接泛素化作用，不受内源其他调控因子影响；

灵活的泛素变体支持：可使用K48-only、K63-only、K0、His-泛素、HA-泛素等多种泛素突变体及标签变体，满足不同研究需求；

双检测平台可选：同时支持Western Blot（检测泛素化信号强度/拖尾形态）和质谱（精确定位泛素化位点），兼顾效率与深度；

一站式全流程服务：从基因合成、蛋白表达纯化到体外泛素化反应、检测鉴定的闭环技术服务；

去泛素化实验配套支持：不仅提供正向泛素化实验，还可配套DUB活性检测服务，全面覆盖泛素化-去泛素化动态调控研究；

周期短、效率高：体外生化反应快速高效，无需构建细胞模型或转基因动物，大幅缩短验证周期。

样本要求与交付周期

样本类型    要求    备注

E3/底物基因信息    提供基因ID、CDS序列或氨基酸序列    用于载体构建及蛋白表达

纯化蛋白（客户提供）    E3≥10μg；底物≥20μg（浓度≥0.5μg/μL）    需提供纯度及活性信息

E1/E2蛋白（客户提供）    各≥5μg    若缺失，我方提供配套商业来源的E1/E2

泛素及泛素突变体（客户提供）    野生型泛素≥20μg    若缺失，我方提供配套商业来源的泛素

目的蛋白抗体    用于泛素化WB检测的抗体    推荐泛素抗体FK2/P4D1及底物特异性抗体

交付周期：

重组蛋白表达+泛素化检测：4~6周

客户提供蛋白+泛素化检测：1~2周

泛素化位点质谱鉴定：额外增加2~3周

去泛素化实验（含DUB表达/纯化）：4~6周（若客户提供DUB，1~2周）

交付内容：

完整的实验报告（含蛋白纯化记录、反应体系参数、检测方法等）；

原始数据及结果图片（Western Blot胶片/成像图，质谱谱图等）；

泛素化信号定量分析（灰度比值或反应动力学曲线）；

若委托质谱鉴定，交付泛素化位点鉴定报告（含修饰位点、泛素链类型分析）；

实验结论及结果解读。

常见问题（FAQ）

Q：体外泛素化实验与细胞内的泛素化检测有什么不同？

A：细胞内的泛素化检测（如泛素化WB检测细胞裂解液）反映的是细胞内在生理状态下底物是否已被泛素化修饰，但无法明确是哪个E3连接酶介导的。体外泛素化实验则是在受控的体外体系中，直接验证特定E3连接酶是否能够直接催化底物的泛素化，是因果关系验证的“金标准”手段。两者互为补充：体内实验回答“有没有被泛素化”，体外实验回答“是由哪个E3泛素化修饰的”。

Q：体外泛素化实验能区分K48-泛素化和K63-泛素化吗？

A：能。我们提供两种策略进行区分：① 使用泛素突变体（如K48-only仅能形成K48连接，K63-only仅能形成K63连接），通过对比不同突变体下的泛素化条带形态差异来判断连接类型；② 使用连接特异性抗体（如抗K48-泛素链或抗K63-泛素链抗体）进行Western Blot检测，可直接鉴定泛素链的连接类型。K48-泛素化通常形成高分子量弥散带，K63-泛素化形成的条带更为离散、分子量更高且常呈阶梯状。

Q：体外泛素化反应的“拖尾条带”不清晰或完全检测不到怎么办？

A：出现这种情况时，我们提供系统的优化方案：① 调整E1:E2:E3的摩尔比（通常E3为限速酶，适当提高其占比），不同E3对E2的偏好性不同，我们的技术团队会根据您的E3类型推荐最优配比（如RING型与HECT型E3的配比方案差异显著）；② 优化ATP浓度、Mg²⁺浓度、DTT及反应温度；③ 延长反应时间；④ 改用灵敏度更高的检测抗体（如FK2单抗）。泛素化信号微弱可能也意味着E3活性不足——我们的预实验会评估E3蛋白的折叠状态与活性，确保投入反应的E3具有正确构象。

Q：体外泛素化实验中观察到E2的自泛素化背景怎么办？

A：某些E2酶本身具有自泛素化能力，可能在体外反应中产生背景信号，干扰底物泛素化的判读。我们通过设置无E3对照组来识别E2自泛素化背景，并结合底物特异性抗体（而非泛素抗体）进行检测，优先捕捉底物蛋白本身分子量的上移，以此区分底物泛素化与E2自泛素化。

Q：体外泛素化实验能直接证明底物被降解吗？

A：不能直接证明。泛素化是降解的信号，但并非所有泛素化都导致降解（如K63-泛素化主要参与信号转导而非降解）。若需验证泛素化是否导致底物降解，建议进一步开展体外降解实验（将泛素化反应产物与纯化26S蛋白酶体共孵育，检测底物剩余量）或细胞/动物水平的蛋白稳定性实验（CHX追踪实验）。我们可配套提供体外降解检测服务，具体请咨询。

Q：去泛素化实验需要哪些组分？为什么检测不到切割活性？

A：去泛素化实验的核心组分为：① 泛素化底物（通过体外泛素化反应制备，其制备质量直接影响后续DUB切割效果）；② DUB酶（纯化重组DUB或免疫沉淀内源DUB复合物）；③ 反应缓冲液（含DTT等还原剂维持DUB活性中心的半胱氨酸处于还原状态）。如果检测不到切割活性，可能原因包括：DUB活性中心被氧化（可通过补充DTT解决）、泛素化底物的连接类型与DUB偏好性不匹配（DUB对K48/K63链有不同偏好）、反应时间或温度不适宜。我们会通过设置阳性对照底物来确认DUB活性。

Q：能否做泛素化相关的药物筛选（E3/DUB抑制剂）？

A：可以。我们提供完整的E3连接酶和DUB抑制剂筛选服务。在体外泛素化或去泛素化反应体系中加入梯度浓度的小分子化合物（或天然产物提取物），通过检测泛素化信号的增强（E3抑制剂）或减弱（DUB抑制剂）来判断药效，并计算IC₅₀值。支持单浓度初筛与全浓度IC₅₀精确测定两种模式。

欢迎联系我们的技术团队，获取免费体外泛素化实验方案设计与报价。我们致力于以专业、规范、可重复的体外泛素化检测服务，为您的泛素化修饰机制研究与药物靶点验证提供最可靠的数据支撑。