柠檬酸（citric acid, CA）含量测定试剂盒说明书
微量法100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
CA是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA是三羧酸循环第一步反应的产物。
测定原理：
酸性条件下，柠檬酸还原Cr6+生成Cr3+，在545nm处有特征吸收峰；通过测定545nm吸光值的增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。
组成：
产品名称 | KC021-100T/96S | Storage |
试剂一：液体 | 1瓶 | 4℃ |
试剂二：液体 | 1瓶 | 4℃ |
试剂三：液体 | 1管 | -20℃ |
试剂四：粉剂 | 1管 | 室温 |
试剂五：液体 | 1管 | 4℃避光 |
标准品：液体 | 1管 | 4℃ |
说明书 | 一份 |
试剂四：粉剂×1管，室温保存。临用前配制，加入2ml试剂一，充分溶解。
标准品：液体×1管，250μmol/L柠檬酸标准液，4℃保存。
自备仪器和用品：
低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
样品中柠檬酸提取：
液体样品中柠檬酸提取：取0.1ml液体加试剂一0.9ml，充分混匀，11000g， 4℃离心10min，取上清液，待测。
组织中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一）进行冰浴匀浆。11000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
线粒体中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一）进行冰浴匀浆，600g/min，4℃离心5min；取上清至另一EP管中，11000g，4℃离心10min，弃上清（此上清液可用于细胞质CA含量测定）；向沉淀中加试剂二200μl，以及试剂三2μl，充分悬浮溶解，11000g，4℃离心10min，取上清液，待测。
细菌、真菌中：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；11000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到545 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂一置于30℃水浴中预热30min。
3. 空白管：取0.5 ml EP管，依次加入20μl蒸馏水，140μl试剂一，20μl试剂四，20μl试剂五，混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A空白管。
4. 标准管：取0.5 ml EP管，依次加入20μl标准液，140μl试剂一，20μl试剂四，20μl试剂五，混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A标准管。
5. 测定管：取0.5 ml EP管，依次加入20μl上清液，140μl试剂一，20μl试剂四，20μl试剂五，充分混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A测定管。
注意：空白管和标准管只需测定一次。
计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
按液体样品的体积计算
柠檬酸含量（nmol/L）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×样品稀释倍数×V总
= 2500×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)
C标准液：250μmol/L=0.25 m mol/L；样品稀释倍数：（0.1 ml样品+0.9ml试剂一）÷ 0.1 ml样品=10；V总：1ml。
按组织质量计算
柠檬酸含量（nmol/g 鲜重）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V总÷W
= 250×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W
C标准液：250 μ mol/L；V总：上清液总体积，1.0 ml=0.001 L；W：样品质量，g。
按蛋白含量计算
柠檬酸含量（nmol/mg prot）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷Cpr
= 250×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr
C标准液：250 μ mol/L=0.25μ mol/ml；Cpr：上清液蛋白质含量，mg/ml。
按细胞数量计算
柠檬酸含量（nmol/104 cell）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V总÷细胞数量
= 250×(A测定管－A空白管) ÷(A标准管－A空白管) ÷细胞数量
C标准液：250 μ mol/L；V总：上清液总体积，1.0 ml=0.001 L；
b.使用96孔板测定的计算公式如下
按液体样品的体积计算
柠檬酸含量（nmol/L）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×样品稀释倍数×V总
= 2500×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)
C标准液：250μmol/L=0.25 m mol/L；样品稀释倍数：（0.1 ml样品+0.9ml试剂一）÷ 0.1 ml样品=10；V总：1ml。
按组织质量计算
柠檬酸含量（nmol/g 鲜重）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V总÷W
= 250×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W
C标准液：250 μ mol/L；V总：上清液总体积，1.0 ml=0.001 L；W：样品质量，g。
按蛋白含量计算
柠檬酸含量（nmol/mg prot）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷Cpr
= 250×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr
C标准液：250 μ mol/L=0.25μ mol/ml；Cpr：上清液蛋白质含量，mg/ml。
按细胞数量计算
柠檬酸含量（nmol/104 cell）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V总÷细胞数量
= 250×(A测定管－A空白管) ÷(A标准管－A空白管) ÷细胞数量
C标准液：250 μ mol/L；V总：上清液总体积，1.0 ml=0.001 L；
注意事项：
1. 样品处理等过程均需要在冰上进行。
2. 试剂四需现配现用，配置好的一周内使用完；
3. 试剂五为易致癌物质，实验过程中，需佩戴手套，避免试剂五溅到皮肤上。
4. 柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定，如需测定蛋白含量，需另取组织，使用本公司BCA试剂盒进行测定。
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