酵母焦磷酸酶

基本信息‌

‌中文名称‌：酵母焦磷酸酶

货号：P-PR1396

规格：20U、100U

‌英文名称‌：Yeast Pyrophosphatase
作用机制：催化焦磷酸（PPi）水解为两个磷酸根离子，通过去除焦磷酸，驱动核酸合成、多糖合成等可逆反应向正向进行；可提高DNA/RNA聚合反应的效率，减少副产物积累，酵母来源的蛋白适配真核体外反应体系。 

适用样本：体外DNA/RNA合成体系、PCR反应优化、酶促反应平衡调控实验
产品概述

酵母焦磷酸酶是一种可催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐的酶类，其反应式为 P2O74−+H2O+PPase→2HPO42−P2O74−+H2O+PPase→2HPO42−。该反应是高放能反应，能为蛋白、RNA和DNA的生物合成提供热力学动力，还可在脂代谢、钙吸收以及骨形成等生物转化过程中发挥作用，在分子生物学中常被用于反转录反应以提高RNA产量。

产品组成

一般为利用大肠杆菌大规模发酵表达的重组酵母来源无机焦磷酸酶，无额外添加的其他复杂成分。

产品特点

·金属依赖性：属于金属蛋白酶，达到最大活性需要Mg2+Mg2+的参与。

·温度特性：最佳反应温度为25℃，65℃处理10分钟可使该酶失活。

·功能多样：可提高反转录反应中RNA产量，增强DNA复制能力；SDS - PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带，酶动力学实时荧光法显示无RNA酶污染。

操作步骤

.获得目的基因

·PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对在上游和下游分别引入不同酶切位点的引物，进行PCR循环获得所需基因片段。

·RT - PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板逆转录形成cDNA第一链，再以此逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

.构建重组表达载体

·将表达质粒用与引物酶切位点相同的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

·PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

.获得含重组表达质粒的表达菌种

·将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的抗Amp或蓝白斑等标志进行筛选，挑取单斑，用碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

·测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确后，以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞；若不正确则需筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

.诱导表达

·挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml含50μg/ml Amp的LB培养基中，37℃过夜培养。

·按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50ml LB培养基的300ml培养瓶中，37℃震荡培养至OD600约为0.4 - 1.0（最佳为0.6，大约需3小时）。

·取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3小时。

·分别取菌体1ml，12000g离心30秒收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀，70℃处理10分钟。

·12000g离心1分钟，取上清作为样品，可做SDS - PAGE等分析。

注意事项

·避免反复冻融或频繁暴露于温度变化中，首次使用时建议进行分装。

·使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于 - 20℃保存。

·该酶在多种反应Buffer中均具有活性，通常在HDA、LAMP等实验中可直接加入。

·该酶的用量在不同实验中需要优化，通常在0.05 - 1U/ml浓度范围内调整。

·Mg2+Mg2+对于酶发挥活性是必须的，反应体系中需保证有足够的Mg2+Mg2+。

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