导读： 流感嗜血杆菌是引起社区获得性肺炎、脑膜炎和中耳炎的重要病原体，其药敏试验因对培养基和培养条件的特殊要求而具有较高的技术难度。ATCC 49247作为CLSI指定的流感嗜血杆菌药敏质控标准菌株，在该菌的体外药敏评价体系中扮演着不可替代的角色。本文重点介绍嗜血杆菌药敏的特殊技术要求及该菌株的质控应用。
菌株基本信息
ATCC 49247的学名为 Haemophilus influenzae，是一株β-内酰胺酶阴性的氨苄西林敏感菌株（BLNAR-negative）。该菌株在CLSI M100中被指定为流感嗜血杆菌药敏试验的标准质控菌，覆盖β-内酰胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类等多个药物类别。
| 项目 | 内容 |
|------|------|
| 学名 | Haemophilus influenzae |
| ATCC编号 | 49247 |
| 生物安全等级 | BSL-2 |
| 推荐培养基 | HTM（Haemophilus Test Medium） |
| 培养温度 | 35±2°C |
| CO₂需求 | 5% CO₂ |
| 关键特征 | β-内酰胺酶阴性，氨苄西林敏感 |
生物学特性与形态
ATCC 49247为革兰阴性小杆菌（球杆菌），在巧克力琼脂（含X因子和V因子）上35°C、5% CO₂培养18-24小时后，菌落小、光滑、灰白色、透明。该菌氧化酶阳性、卟啉试验（ALA）阴性——后者说明它需要外源X因子（血红素）才能生长。
嗜血杆菌的生长依赖两种辅因子：X因子（血红素/氯化血红素）和V因子（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/NAD）。这一特性直接决定了药敏试验培养基的特殊要求——普通MHA不含X和V因子，不支持嗜血杆菌生长。
培养条件与操作要点
HTM培养基——嗜血杆菌药敏的专用培养基
CLSI M100明确规定，流感嗜血杆菌药敏试验必须使用HTM（Haemophilus Test Medium），而非普通MHA。HTM的组成：
Mueller-Hinton琼脂基础
添加酵母提取物（5 g/L）
添加β-NAD（V因子，15 μg/mL）
添加牛血红素（X因子，15 μg/mL）
pH 7.2-7.4
HTM的商业化产品可从主要培养基供应商处购买预制平板。如果实验室自行配制，X因子和V因子的添加浓度必须精确控制——浓度不足会导致嗜血杆菌生长不良，浓度过高则可能影响某些抗生素的活性。
接种与培养
从巧克力琼脂平板上挑取新鲜菌落（24小时以内），悬浮于生理盐水中
调整浊度至0.5号麦氏标准
用棉签在HTM平板上密涂三遍
室温放置3-5分钟，贴抗生素纸片
在5% CO₂环境中35°C培养16-18小时
特别注意： 嗜血杆菌必须在CO₂环境中培养，这是与前述革兰阴性杆菌药敏试验的最大区别。CO₂浓度的波动可能影响某些药物的抑菌圈大小，因此CO₂培养箱的浓度校准非常重要。
在各标准中的应用
CLSI M100中的应用
K-B法（HTM平板）质控抑菌圈范围：
| 抗生素 | 纸片含量 | 抑菌圈范围(mm) |
|--------|----------|---------------|
| 氨苄西林 | 10μg | 19-25 |
| 阿莫西林/克拉维酸 | 20/10μg | 19-25 |
| 头孢呋辛 | 30μg | 20-28 |
| 头孢噻肟 | 30μg | 30-38 |
| 头孢他啶 | 30μg | 23-31 |
| 美罗培南 | 10μg | 20-28 |
| 环丙沙星 | 5μg | 30-40 |
| 阿奇霉素 | 15μg | 13-21 |
| 复方新诺明 | 1.25/23.75μg | 24-32 |
| 氯霉素 | 30μg | 25-31 |
MIC法（HTM肉汤）质控范围（μg/mL）：
| 抗生素 | MIC范围 |
|--------|---------|
| 氨苄西林 | 0.25-1 |
| 头孢噻肟 | 0.015-0.06 |
| 头孢呋辛 | 0.5-2 |
| 美罗培南 | 0.03-0.12 |
| 环丙沙星 | 0.004-0.03 |
| 阿奇霉素 | 1-4 |
β-内酰胺酶检测
ATCC 49247为β-内酰胺酶阴性株。头孢硝噻吩试验应为阴性结果。该菌株可用于验证β-内酰胺酶检测系统的阴性对照端。
对于β-内酰胺酶阳性株的质控需求，可使用ATCC 49766（产TEM-1型β-内酰胺酶的流感嗜血杆菌）。
行业质控用途
嗜血杆菌药敏室内质控： 每日进行嗜血杆菌相关药敏试验时，同步接种ATCC 49247进行质控。
HTM培养基批次验证： 每批新到的HTM平板须用ATCC 49247验证，确认抑菌圈在允许范围内——这是对HTM培养基中X因子和V因子含量是否充足的间接检验。
BLNAR检测辅助参考： 氨苄西林耐药但β-内酰胺酶阴性的流感嗜血杆菌（BLNAR）因PBP3突变导致耐药，头孢硝噻吩试验无法检出。ATCC 49247作为氨苄西林敏感株，可辅助验证氨苄西林纸片/MIC的基线准确性。
菌种保藏与管理
嗜血杆菌的保藏管理比普通细菌更需注意：该菌在普通MHA斜面上无法存活，工作菌种须保存在巧克力琼脂斜面上（含X/V因子），2-8°C保存不超过1-2周。推荐-80°C甘油冻存作为长期保存手段。
嗜血杆菌在连续传代过程中活力衰减较快，笔者建议每2周从冻存管复苏一支新工作菌种。
安全注意事项
BSL-2级别。流感嗜血杆菌可引起脑膜炎、肺炎和会厌炎等严重感染。操作须在II级生物安全柜内进行，特别注意避免气溶胶产生。
常见问题与工程师建议
Q1：HTM平板和普通巧克力琼脂在药敏试验中可以互换吗？
不可以。巧克力琼脂虽然也含X和V因子（通过加热红细胞释放），但其组成未经标准化，不同批次的因子含量差异较大，可能导致抑菌圈大小不稳定。CLSI明确规定嗜血杆菌药敏试验必须使用HTM，不应使用巧克力琼脂替代。
Q2：ATCC 49247的抑菌圈整体偏小，如何排查？
首先检查HTM平板中X因子和V因子的含量——因子含量不足会导致嗜血杆菌生长不良，菌苔薄而不均匀，抑菌圈偏小甚至无法判读。其次确认CO₂浓度（5%±1%），CO₂过高会降低某些药物的活性。最后检查菌液浊度是否准确。
Q3：BLNAR菌株在药敏试验中如何识别？
BLNAR（β-Lactamase Negative Ampicillin-Resistant）菌株头孢硝噻吩试验阴性但氨苄西林MIC升高（≥4 μg/mL或纸片法抑菌圈偏小）。如果ATCC 49247的氨苄西林质控结果正常（MIC 0.25-1），但患者分离株头孢硝噻吩阴性而氨苄西林耐药，应怀疑BLNAR。BLNAR菌株对所有口服β-内酰胺类药物均应报告耐药。
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