ATCC 9027铜绿假单胞菌：标准菌株特性、药典应用与质控实践

导读

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是微生物质控实验室中最常见的标准菌株之一，也是药品、化妆品、消毒剂等行业微生物检测中的"老面孔"。ATCC 9027作为该菌种的经典参考菌株，在各国药典和国际标准中均有广泛应用。本文结合笔者多年实验室工作经验，对该菌株的基本特性、培养要点、药典应用及日常管理进行系统梳理，希望能为同行提供一些实用参考。

1. 菌株基本信息

ATCC 9027的分类学全称为 Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) Migula，来源于美国，属于生物安全二级(BSL-2)病原微生物。在实验室日常管理中，需要按照BSL-2级别进行相应的安全防护和操作规范。

该菌株在ATCC、CMCC等主流菌种保藏中心均有供应，是微生物质控领域使用频率最高的铜绿假单胞菌参考株之一。需要注意的是，不同保藏中心可能对同一菌株有不同的编号，购买时务必核对原始ATCC编号，确保溯源链完整。

2. 生物学特性与形态

铜绿假单胞菌为革兰阴性杆菌，菌体细长，具有鞭毛，运动活泼。在显微镜下观察，典型形态为直或略弯的杆状，单个或成对排列。

该菌的生化特征比较明确：氧化酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性。在特定培养基上可产生绿色荧光色素，部分条件下还能产生蓝绿色的绿脓菌素(pyocyanin)，这是铜绿假单胞菌非常典型的鉴别特征。笔者在实际工作中发现，绿脓菌素的产生与培养基成分和培养时间密切相关，有时需要延长培养时间才能观察到明显的色素沉着。

从鉴定角度来说，氧化酶阳性加上特征性色素产生，基本可以做出初步判断。如需确证，建议结合生化鉴定系统或质谱(MALDI-TOF MS)进行确认。

3. 培养条件与操作要点

ATCC 9027的常规培养温度为35-37°C，培养时间一般为24小时。适用的培养基范围较广，包括：

• TSB(胰酪大豆胨液体培养基)：用于增菌培养和菌悬液制备

• TSA(胰酪大豆胨琼脂)：用于常规平板培养和活菌计数

• Nutrient agar(营养琼脂)：可用于一般性传代培养

• PDP琼脂(绿脓菌素测定培养基)：专用于绿脓菌素(pyocyanin)的产生和检测

• CN琼脂(假单胞菌选择性琼脂)：用于选择性分离和鉴别

在CN琼脂上进行鉴别培养时，推荐操作如下：将待检菌接种于CN琼脂平板，36°C培养24小时。培养后在UV 366nm紫外灯下观察，铜绿假单胞菌会产生特征性的黄绿色荧光，这是由绿脓菌荧光素(pyoverdine)引起的。同时可进一步做绿脓菌素确认试验，并配合氧化酶试验和硝酸盐还原试验进行综合判定。

有一点值得提醒：CN琼脂上的荧光观察最好在暗室中进行，环境光太强会影响荧光判读。另外，平板不宜过于干燥，否则荧光信号会减弱。

4. 在各药典及标准中的应用

铜绿假单胞菌作为标准质控菌株的应用范围非常广泛，几乎涵盖了药品、化妆品、消毒产品等所有涉及微生物控制的领域。以下按标准体系分别说明。

美国药典(USP)中的应用

ATCC 9027在USP中有多个章节的引用。在USP \<51\>Antimicrobial Effectiveness Testing(抑菌效力检查)中，铜绿假单胞菌是五种必测挑战菌之一，用于评估药品防腐体系的抑菌能力。在USP \<61\>Microbial Enumeration Tests(微生物计数法)中，作为培养基适用性检查和计数方法验证的质控菌株。在USP \<62\>Tests for Specified Microorganisms(特定微生物检查)中，铜绿假单胞菌被明确列为控制菌(control microorganism)，即非无菌药品中不得检出的特定病原菌之一。

欧洲药典(EP)中的应用

欧洲药典EP 2.6.12和EP 2.6.13分别对应非无菌产品的微生物计数和特定微生物检查，ATCC 9027在两个章节中均作为参考菌株使用。EP 5.1.3和EP 5.1.4涉及抑菌效力评价和培养基质量控制，铜绿假单胞菌同样是标准挑战菌种。与美国药典相比，欧洲药典在具体操作细节上的描述略有差异，但核心要求基本一致。

中国药典中的应用

《中国药典》2020版四部通则对铜绿假单胞菌有明确规定。通则1105(非无菌药品微生物限度标准)将铜绿假单胞菌列为控制菌之一，即特定给药途径和剂型的药品中不得检出。通则1106(非无菌药品微生物限度检查：控制菌检查法)规定了铜绿假单胞菌的增菌、选择性分离和确证鉴定的完整检验流程。通则1107涉及非无菌药品微生物限度检查中的微生物计数法。通则1121(抑菌效力检查法)同样将铜绿假单胞菌作为防腐挑战试验的标准菌种之一。

在实际药品微生物限度检查中，铜绿假单胞菌是必检控制菌项目之一，尤其是用于皮肤、黏膜、眼用、耳用、鼻用等局部给药制剂，检查要求更为严格。这也是QC实验室日常检测工作量较大的一个项目。

消毒技术规范与国标中的应用

《消毒技术规范》(2002年版)将铜绿假单胞菌列为消毒剂杀菌效力鉴定的标准试验菌株之一。在消毒剂产品的杀菌效果评价试验中，ATCC 9027(或等效菌株)是必须使用的代表菌种。此外，GB 15979《一次性使用卫生用品卫生标准》也涉及铜绿假单胞菌的卫生指标要求。

ISO国际标准中的应用

在ISO标准体系中，铜绿假单胞菌同样扮演着重要角色。ISO 11930规定了化妆品防腐剂效力评价方法，ATCC 9027是其中的标准挑战菌种。ISO 22196用于评价塑料及其他非多孔材料表面的抗菌性能，铜绿假单胞菌是测试用菌之一。在抗菌材料、抗菌涂料等新兴领域，该菌株的应用也越来越普遍。

5. 在行业质控中的典型用途

从笔者的实际经验来看，ATCC 9027在QC实验室的用途主要集中在以下几个方面：

一是作为防腐剂挑战试验的标准菌种，用于药品、化妆品等产品防腐体系的抑菌效力评价。这是该菌株用量最大的应用场景。

二是用于微生物计数方法(平皿计数、MPN法等)的方法验证，确认所采用的培养基和培养条件能够有效回收铜绿假单胞菌。

三是用于控制菌检查方法的验证和日常质控，确保实验室的检测系统具备检出铜绿假单胞菌的能力。

四是用于消毒剂效力评价试验，作为革兰阴性菌的代表菌种参与杀菌效力测试。

6. 菌种保藏与传代管理

菌种管理的规范性直接关系到质控结果的可靠性。ATCC 9027收到后，建议首先进行复苏和纯度确认，然后制备工作储备菌种。长期保藏推荐采用甘油冻存法(-70°C以下)或冷冻干燥保藏。

传代次数控制是菌种管理的核心要点之一。根据药典要求，标准菌株从复苏到使用，传代次数一般不应超过5代。实验室应建立完善的菌种传代记录体系，每一代都要记录复苏日期、传代日期、传代培养基、操作人员等信息。笔者见过不少实验室在菌种管理上出问题，根本原因往往是传代记录不完整或传代次数失控。

工作菌悬液的制备也很关键。用于挑战试验或方法验证的菌悬液，应使用新鲜培养物(一般为18-24小时培养物)，并用适当的稀释液调整至目标浓度。菌悬液的活菌计数应在每次使用时同步进行。

7. 操作安全与注意事项

铜绿假单胞菌属于BSL-2级别的病原微生物，是一种条件致病菌(opportunistic pathogen)。对于免疫功能正常的人群，一般不易致病，但对于免疫力低下者、烧伤患者、囊性纤维化患者等高风险人群，该菌可引起严重的机会性感染，包括肺部感染、伤口感染甚至败血症。

因此，实验室操作必须严格遵守BSL-2级别的安全规范：

• 在生物安全柜(BSC)内进行所有可能产生气溶胶的操作

• 操作人员应穿戴实验服、手套，必要时佩戴护目镜或面罩

• 操作完毕后对工作台面和器具进行有效消毒(含氯消毒剂或75%乙醇)

• 废弃物须经高压灭菌后方可处置

• 实验室应配备洗眼设施和应急处理方案

特别提醒一点：铜绿假单胞菌对多种消毒剂和抗生素具有天然耐药性，这也使得它成为消毒剂效力试验的理想挑战菌种。但这也意味着，实验室日常消毒方案的制定需要考虑该菌的特殊性，常规的季铵盐类消毒剂对铜绿假单胞菌的效果往往不理想。

8. 常见问题与工程师建议

Q1：CN琼脂上未观察到荧光，是否说明不是铜绿假单胞菌？

不一定。荧光产生受多种因素影响，包括培养基批次、培养温度、培养时间和平板湿度等。建议首先确认培养基是否在有效期内、培养条件是否符合要求。如果条件均正常仍无荧光，可结合氧化酶试验和绿脓菌素试验进行综合判定。必要时使用生化鉴定系统做进一步确认。

Q2：防腐挑战试验中铜绿假单胞菌的回收率偏低怎么办？

这种情况在实际工作中比较常见。首先要排查菌悬液的制备环节，确认活菌计数是否准确、接种量是否达标。其次检查产品本身是否存在抑菌性，是否需要在中和剂验证环节进行调整。另外，培养基的适用性也要同步确认，有时候问题可能出在培养基的批间差异上。

Q3：菌种传代超过5代了还能用吗？

严格来说，按照药典要求，超过规定传代次数的菌株不应再用于法定质控检验。传代次数过多的菌株可能发生表型变异，如色素产生能力下降、生长特性改变等，影响质控结果的可靠性。建议及时制备新的工作储备菌种，从原始冻存管重新开始复苏和传代。

Q4：如何区分铜绿假单胞菌和其他假单胞菌属细菌？

铜绿假单胞菌最突出的鉴别特征是氧化酶阳性、产生绿脓菌素或绿色荧光色素、硝酸盐还原阳性。其他假单胞菌(如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌)虽然也可能产生荧光色素，但通常不产生绿脓菌素，且最适生长温度往往低于37°C。综合多项生化指标并结合生长温度特征，一般可以做出准确区分。

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免责声明： 本文所述菌株信息及技术参数均来源于ATCC官网、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、《中国药典》2020年版、ISO国际标准及《消毒技术规范》等公开权威资料，仅供专业技术参考。具体实验操作请以产品随附的质检报告(COA)和说明书为准，并严格遵守所在机构的生物安全管理制度。本文不构成任何产品推荐或使用建议。

关键词标签: ATCC 9027, 铜绿假单胞菌, Pseudomonas aeruginosa, 标准菌株, 药典, 微生物检测, 控制菌检查, 消毒试验