产品名称:葡萄球菌属通用PCR检测试剂盒
英文名称:Staphylococcus spp.PCR
货号:YS-P014777
分类:PCR检测试剂盒
规格:50T/盒
检测原理:
引物靶向葡萄球菌属高度保守的 16S rRNA 基因区段,可扩增属内绝大多数菌种核酸。
只要样本存在任意葡萄球菌基因组 DNA,即可启动特异性 PCR 扩增反应。
电泳出现属特异性扩增条带,仅可判定检出葡萄球菌属细菌,无法区分具体菌种。
实验流程:
(一)反应体系配制(冰上操作,防酶失活与污染)
按 “水→缓冲液→dNTP→引物→模板→Taq 酶” 顺序加样(酶最后加,避免失活)。
轻轻涡旋混匀,短暂离心(3000rpm,10s),使液体沉至管底。
无热盖的 PCR 仪:加 1 滴矿物油覆盖液面,防止蒸发。
(二)PCR 程序设置(标准 35 循环)
预变性:94℃,3-5min(彻底变性模板 DNA)。
循环阶段(35 次):
变性:94℃,30s(双链解链)。
退火:55-65℃,30s(引物结合模板,按引物 Tm 值调整)。
延伸:72℃,1min/kb(Taq 酶合成新链,1kb 片段约 1min)。
终延伸:72℃,5-10min(确保片段完整延伸)。
保温:4℃,∞(防止非特异性复性,短期保存)。
(三)产物检测(琼脂糖凝胶电泳)
制胶:1% 琼脂糖凝胶(1g 琼脂糖 + 100mL 1×TAE 缓冲液),加热融化后加核酸染料,倒胶插梳,凝固 30min。
上样:取 5μL PCR 产物 + 1μL 上样缓冲液,点样;同时加 DNA Marker(分子量对照)。
电泳:120V,20-30min,至溴酚蓝迁移至凝胶 2/3 处。
成像:凝胶成像系统观察条带,目标片段位置与预期一致则为阳性。
四、参数优化
退火温度(Tm):引物 Tm 值 = 4×(G+C)+2×(A+T),退火温度一般低于 Tm 值 5℃,温度过高无条带,过低非特异性条带多。
Mg²⁺浓度:1.5-2.5mM,浓度过低酶活性低、产量少;过高非特异性扩增增加。
循环数:25-35 个循环,少于 25 个产物不足,多于 35 个易出现非特异性条带。
延伸时间:按目标片段长度调整,≤1kb 用 1min,1-3kb 用 2-3min。
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注意事项:
试剂禁止反复冻融,分装为小体积 - 20℃保存,融化后冰上放置不超过 2 h
所有耗材必须无 DNase/RNase,吸头一次性使用,废液、废弃 PCR 管 121℃高压灭菌后丢弃
阳性质粒高拷贝,开盖全程在生物安全柜操作,防止气溶胶污染实验室
试剂盒仅限科研检测,禁止人、临床样本检测
试剂盒过期、试剂浑浊、变色禁止使用
若大量样本出现阴性对照带污染,立即更换全新试剂盒,彻底紫外消毒实验台面、移液器
关键字: 葡萄球菌属通用;PCR检测试剂盒;
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