产品名称：草鱼出血热病毒(GCHV)核酸检测试剂盒
英文名称：Grass Carp Hemorrhagic Virus (GCHV) Nucleic Acid Detection Kit
货号：YS-P015487
分类：核酸检测试剂盒
规格：50T/盒
检测原理：
VP5 衣壳基因 RT-qPCR 探针法，靶向草鱼出血病毒衣壳蛋白基因，检测病鱼脾脏、血液样本。
巢式 RT-PCR 低载量富集原理，潜伏感染草鱼体内病毒浓度低，两轮扩增提高检出灵敏度。
恒温荧光 CPA 扩增，淡水鱼塘现场粗提鱼组织，无需大型 PCR 设备快速诊断出血病。
实验流程：
（一）反应体系配制（冰上操作，防酶失活与污染）
按 “水→缓冲液→dNTP→引物→模板→Taq 酶” 顺序加样（酶最后加，避免失活）。
轻轻涡旋混匀，短暂离心（3000rpm，10s），使液体沉至管底。
无热盖的 PCR 仪：加 1 滴矿物油覆盖液面，防止蒸发。
（二）PCR 程序设置（标准 35 循环）
预变性：94℃，3-5min（彻底变性模板 DNA）。
循环阶段（35 次）：
变性：94℃，30s（双链解链）。
退火：55-65℃，30s（引物结合模板，按引物 Tm 值调整）。
延伸：72℃，1min/kb（Taq 酶合成新链，1kb 片段约 1min）。
终延伸：72℃，5-10min（确保片段完整延伸）。
保温：4℃，∞（防止非特异性复性，短期保存）。
（三）产物检测（琼脂糖凝胶电泳）
制胶：1% 琼脂糖凝胶（1g 琼脂糖 + 100mL 1×TAE 缓冲液），加热融化后加核酸染料，倒胶插梳，凝固 30min。
上样：取 5μL PCR 产物 + 1μL 上样缓冲液，点样；同时加 DNA Marker（分子量对照）。
电泳：120V，20-30min，至溴酚蓝迁移至凝胶 2/3 处。
成像：凝胶成像系统观察条带，目标片段位置与预期一致则为阳性。
四、参数优化
退火温度（Tm）：引物 Tm 值 = 4×(G+C)+2×(A+T)，退火温度一般低于 Tm 值 5℃，温度过高无条带，过低非特异性条带多。
Mg²⁺浓度：1.5-2.5mM，浓度过低酶活性低、产量少；过高非特异性扩增增加。
循环数：25-35 个循环，少于 25 个产物不足，多于 35 个易出现非特异性条带。
延伸时间：按目标片段长度调整，≤1kb 用 1min，1-3kb 用 2-3min。
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注意事项：
试剂禁止反复冻融，分装为小体积 - 20℃保存，融化后冰上放置不超过 2 h
所有耗材必须无 DNase/RNase，吸头一次性使用，废液、废弃 PCR 管 121℃高压灭菌后丢弃
阳性质粒高拷贝，开盖全程在生物安全柜操作，防止气溶胶污染实验室
试剂盒仅限科研检测，禁止人、临床样本检测
试剂盒过期、试剂浑浊、变色禁止使用
若大量样本出现阴性对照带污染，立即更换全新试剂盒，彻底紫外消毒实验台面、移液器
关键字： 草鱼出血热病毒;GCHV; 核酸检测试剂盒;
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