谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒（DTNB法）
微量法100管48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
谷胱甘肽过氧化物酶（GPx，EC1.11.1.9）代表一种具有过氧化物酶活性的酶家族，GPx能够催化还原型谷胱甘肽（GSH）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物，从而保护生物膜免受 ROS 的损害，维持细胞的正常功能，同时还具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等作用。
测定原理：
谷胱甘肽过氧化物酶可催化H2O2氧化GSH生成GSSG，GSH和DTNB反应生成黄色的TNB，产物在412nm处具有特征吸收峰，通过吸光值下降速率即可表征谷胱甘肽过氧化物酶的活性。
试剂组成和配制：
产品名称 | GSH006-100T/48S | Storage |
提取液：液体 | 120mL | 4℃ |
试剂一：粉剂 | 2瓶 | 4℃避光 |
试剂二：液体 | 1瓶 | 4℃避光 |
试剂三：液体 | 20mL | 4℃避光 |
试剂四：液体 | 20mL | 4℃ |
试剂五：粉剂 | 1瓶 | 4℃避光 |
标准品：粉剂 | 一支 | 4℃ |
说明书 | 一份 |
试剂一：临用前每瓶加入2mL提取液，充分溶解混匀，4℃避光条件下可保存1周。
试剂二工作液：临用前加入5mL纯水，充分混匀，4℃避光条件下可保存2周。
试剂五：临用前加入2.5mL纯水，充分混匀，4℃避光条件下可保存2周。
标准品：临用前加入405μL纯水，充分混匀，即为80μmol/mL GSH母液，4℃避光条件下可保存2周。
需自备仪器和用品：
酶标仪、电子天平、台式离心机、研钵/匀浆器、可调式移液器、96孔板、振荡仪、纯水、冰。
样本处理：
1. 组织：按照组织质量(g) : 提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后12000g，4℃，离心10min后取上清置于冰上待测。
2. 细菌和细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间
3min）；然后12000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清（浆)、培养液等液体样本：吸取100μL液体样本，加入100μL提取液充分混匀，4℃12000g离心10min，取上清置于冰上待测。
测定步骤：
1. 酶标仪预热30min以上。
2. 酶促反应步骤：
试剂名称(µL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 20 |
|
提取液 |
| 20 |
试剂一 | 20 | 20 |
试剂二工作液 | 10 | 10 |
振荡混匀，37℃温育5min |
试剂三 | 100 | 100 |
提取液 | 20 |
|
样本 |
| 20 |
充分混匀，25℃，4000g离心5min，取上清液进行下述显色反应。 |
3. 显色反应步骤
试剂名称(µL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
上清液 | 40 | 40 |
|
|
标准液 |
|
| 40 |
|
蒸馏水 |
|
|
| 40 |
试剂四 | 160 | 160 | 160 | 160 |
试剂五 | 25 | 25 | 25 | 25 |
充分混匀，室温避光静置15min。取200μL至96孔板，测定412nm下的吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A对照管-A测定管，ΔA标准=A标准管-A空白管。注：空白管和各浓度标准管仅需要测1-2次，每个测定管均需设置一个对照管。 |
酶活性计算公式：
标准条件下测定的回归方程为y=1.362x-0.0054，R2=0.9998，x为标准品浓度（µmol/mL），y为吸光值。
1.按蛋白浓度计算：
活性单位定义：在37℃反应条件下，每毫克蛋白每分钟氧化1nmolGSH为1个酶活单位。
GPx(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×103×V反总]÷(Cpr×V样)÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)÷Cpr
2.按样本质量计算：
活性单位定义：在37℃反应条件下，每克样本每分钟氧化1nmolGSH为1个酶活单位。
GPx(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×103×V反总]÷(W×V样÷V提)÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)÷W
3.按细胞数量计算：
活性单位定义：在37℃反应条件下，每104个细胞每分钟氧化1nmolGSH为1个酶活单位。
GPx(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×103×V反总]÷(500×V样÷V提)÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)÷500
4.按液体体积计算：
活性单位定义：在37℃反应条件下，每毫升液体每分钟氧化1nmolGSH为1个酶活单位。
GPx(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×103×V反总]÷V样÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)
V样：酶促反应样本体积，0.02mL；V反总：酶促反应总体积，0.17mL；V提：样本提取中提取液加入量，1mL；W：样品质量，g ；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞数量（万个）；103：1μmol=103nmol；T：反应时间，5min。
注意事项：
1. ΔA线性范围为0.02-1.3，可测定剩余谷胱甘肽浓度范围0.02-1μmol/mL；如果样本ΔA大于1.3，建议用提取液稀释待测样本后重新测定（计算公式中乘以相应稀释倍数），如果ΔA小于0.05，建议适当增加样本量。
2. 建议一次不要做过多样本以免检测时间过长影响显色，防止测定结果不准确。
实验实例：
1. 称取0.2g牛肝，加入1mL提取液研磨匀浆，取上清用提取液梯度稀释，后按测定步骤操作，结果如下：
样本质量 （牛肝） | 0.1g | 0.05g | 0.025g |
A测定 | 0.385 | 0.489 | 0.555 |
A对照 | 0.628 | 0.637 | 0.632 |
ΔA （A对照-A测定） | 0.243 | 0.148 | 0.077 |
GPx酶活 (nmol/min/g 鲜重) | 3100.52 | 3829.47 | 4144.07 |
2. 称取0.1g现取紫叶李叶片，加入1mL提取液研磨匀浆，取上清用提取液梯度稀释，后按测定步骤操作，结果如下：
样本质量 （叶片） | 0.1g | 0.05g |
A测定 | 0.619 | 0.624 |
A对照 | 0.657 | 0.646 |
ΔA （A对照-A测定） | 0.038 | 0.022 |
GPx酶活 (nmol/min/g 鲜重) | 541.72 | 684.01 |
参考文献：
[1]Flohé L, Günzler W A. [12] Assays of glutathione peroxidase[M]. Methods in enzymology. Academic Press, 1984, 105: 114-120.
[2]杨继轩, 任治鹏, 徐悦, 等. 几种禾本科作物幼苗期谷胱甘肽过氧化物酶活力研究[J]. 现代农业科技, 2018 (5): 1-3.
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