质量控制
除胭脂碱型 Ti 质粒 pEHA101 外,无外源质粒 DNA 残留;
化学法转化效率≥ 104 cfu/μg DNA。
使用方法
1. 将感受态细胞从-80 ℃中取出,在手心融化成冰水混合物,置于冰水浴中;
2. 将待转化 DNA 加入到 100 μl 感受态细胞中,用手拨打管底混匀,依次于冰上静置 10 分钟、液氮 5 分
钟(或干冰乙醇浴和-80℃冰冻)、37℃水浴 5 分钟、冰浴 5 分钟;
3.加入 900 μl 无抗生素的 YEB 液体培养基,于 28℃振荡培养 2~3 小时;
4. 6000 rpm 离心一分钟收菌,留取 100 μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的 YEB 平板
上,倒置放于28 ℃培养箱培养2-3天(当平板只含有转化所用双元载体抗生素时,28 ℃培养48 h即可;
平板中同时加入双元载体抗生素,20 μg/ml Rif 时,需 28℃培养 60 h;如果使用的平板含有 50 μg/ml Rif
则需要 28℃培养 72-90 h)。
注意事项
1. 感受态细胞冰浴中解冻后应立即使用;
2. 加入的待转化 DNA 的总体积不应超过感受态细胞体积的 1/10;
3. 利福平浓度不应高于 25 μg/μl,利福平浓度过高不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。
4. 由于 Ti 质粒丢失的概率极低(可以忽略),所以相关抗性基因可以不用添加。