一、人骨髓造血干细胞培养条件
默认种属 | 人 |
组织来源 | 腿骨髓组织 | 消化液 | 0.25%胰蛋白酶 |
细胞背景 | 人骨髓造血干细胞分离自腿骨髓组织；骨髓是机体的造血组织，位于身体的许多骨骼内。成年动物的骨髓分两种：红骨髓和黄骨髓。红骨髓能制造红细胞、血小板和各种白细胞。血小板有止血作用，白细胞能杀灭与抑制各种病原体，包括细菌、病毒等；某些淋巴细胞能制造抗体。因此，骨髓不但是造血器官，它还是重要的免疫器官。骨髓是存在于长骨（如肱骨、股骨）的骨髓腔和扁平骨（如髂骨）的稀松骨质间的网眼中，是一种海绵状的组织，能产生血细胞的骨髓略呈红色，称为红骨髓。出生时，红骨髓充满全身骨髓腔，随着年龄增大，脂肪细胞增多，相当部分红骨髓被黄骨髓取代，最后几乎只有扁平骨骨髓腔中有红骨髓。造血干细胞具有自我更新能力并能分化为各种血细胞的前提细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞，白细胞和血小板。造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下，造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。临床治疗中，造血干细胞移植广泛应用于血液系统疾病以及自身免疫疾病，在其它实体瘤的治疗中，比如淋巴瘤，生殖细胞瘤，乳腺癌，小细胞肺癌，主要应用于常规治疗失败或复发难治以及具有不良预后因素的患者。造血干细胞以不对称有丝分裂方式进行增殖，一个干细胞分裂产生两个子细胞，一个分化为造血祖细胞，另一个则保持干细胞特征。造血干细胞在不断体外培养产生大量造血祖细胞同时，保持自己既不增殖也不分化。体外培养微环境合适，造血干细胞可持续维持培养60天左右。 造血干细胞体外增殖培养需要基质细胞滋养（滋养层细胞），缺少滋养层细胞不增殖，无法长期培养，本产品为收集培养好的造血干悬浮细胞灌装发货，不包含滋养层，因此收货后建议尽快实验。 |
传代方法 | 1:2 | 传代情况 | 不可传代 |
备注 | 本库的细胞仅用于科研工作，未经许可不得用于其他目的，使用者不得将本库细胞转让给第三者。 |
二、人骨髓造血干细胞收货后处理
复苏细胞处理方法：培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是运输细胞的最好办法。收到细胞用75%酒精喷洒整个细胞瓶，严格无菌后将细胞瓶放置培养箱中静置2-4小时以稳定细胞状态。静置后显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（最好40x,100x,200x各一张），前三天照片是重要售后依据，不提供照片默认收到状态良好。
冻存细胞处理方法：收到细胞后，观察泡沫箱中干冰是否有剩余，冻存管是否完好无损是否有解冻情况，若发现干冰完全汽化或冻存管有解冻破损现象，请及时拍照并与我们联系。如果细胞签收三天内未与我们联系，则默认为收货良好。复苏第一管如有活性问题，请及时联系我们，技术人员与您沟通指导后再复苏第二管，未与我方联系擅自复苏第二管出现问题不予售后。
细胞培养步骤
a、细胞传代：如果未超过80%汇合度时，将瓶装的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱培养；如果细胞密度超80%，即可进行传代培养。
贴壁细胞步骤如下：
1) 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次；
2) 加1mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置培养箱中消化 1min ，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后，加6ml含10%血清的完全培养基终止消化；
3) 轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出至离心管中，1000 rpm离心5-8min，弃去上清液，补加1-2mL完全培养基后吹匀；
4) 按5-6mL每瓶补加完全培养基，将细胞悬液按1:2的比例分到新的含5-6 mL完全培养基的6cm培养皿中或者T25培养瓶中。
（即1个T25瓶传代接种至2个T25瓶或者2个6cm的培养皿）
悬浮细胞传代步骤如下：
1、半换液法
半换液处理，竖着培养瓶在培养箱静置1小时左右，轻轻吸掉3ml左右培养基，然后补给3ml的完全培养基，如果培养基变色慢，可直接加500ul左右FBS，传代的时候可以直接补给5ml培养基 分两个培养瓶培养，一般这样传代3次左右可以离心传代一次，去掉死细胞。
2、离心换液法
如需分瓶可以将细胞悬液收集到离心管中1000rpm，离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
b、细胞冻存：
1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心 5min；
3、 弃上清，沉淀细胞加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4、 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要将细胞转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱 中存放24小时以上再转入液氮罐中。
C、细胞复苏：
1、从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置入 37℃水浴中解冻， 直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2、将冻存管中的细胞移至含 5ml 完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3、弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养；
4、第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。
人骨髓造血干细胞注意事项：有些细胞贴壁不牢，在运输过程中容易发生细胞脱落，这是正常现象。如脱离较多可将培养瓶所有培养液收集至离心管，1000rpm离心5min，收集上清作过渡培养（后期对比培养），沉淀加入胰酶1-2ml，轻轻吹打，重悬，消化1-2分钟后，加5ml完全培养基终止反应。再离心，弃上清，加1-2ml完全培养基重悬。然后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO2细胞培养箱中培养
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细胞产品与技术平台：
细胞产品：提供包括正常细胞、肿瘤细胞、肿瘤耐药细胞在内的多种细胞系。同时，公司也是美国ScienCell等品牌的原代细胞产品的代理商。
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科研试剂：这是公司的基础和优势业务。产品线全面覆盖了分子生物学、免疫学、细胞生物学和微生物学等多个学科。
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