荧光素酶

生物发光(Bioluminescence)是在自然界广泛存在的、有生命的生物产生的一种发光现象.发光的生物种类很多，包括发光细菌、发光萤火虫、发光鱼、发光海星、发光甲虫等.而能催化荧光素或脂肪醛氧化产生生物发光的一类酶即为荧光素酶(Luciferase).从20世纪50年代就已经开始了对荧光素酶的研究.从1986年第一个成功地获得表达萤火虫荧光素酶基因(luc基因)的转基因烟草以来，荧光素酶的应用和发展进入了一个崭新的时代.应用荧光素酶大大增加了生物发光免疫分析技术(BLIA)的灵敏度和应用范围，并且由于具有敏感性高，特异性好，反应迅速，操作简单，应用范围广等优点，已成为医学、生物学、环境科学等研究领域中一种新的手段。自然界中具有发光能力的生物种类很多，常见的主要有：发光蘑菇(Luminousmushrooms)、发光蚯蚓(Luminousearthworms、发光细菌(Luminousbacteria)、发光水母(Luminousjellyfish)、发光甲虫(Luminousbeetles，它们主要由萤火虫(fireflies)，叩头虫(clickbeetles)和欧洲萤(glowworms)3大种类组成)。目前，除发光蘑菇和发光蚯蚓的发光机理尚不清楚外，其余生物的发光机理已研究得较为透彻，并使细菌荧光素酶(BacterialLuciferase简称BL)和萤火虫荧光素酶(FireflyLuciferase简称FL)形成商品酶用于分析检测。荧光素酶报告系统也可以作为细菌荧光素酶报告系统的一个替代，特别是对监测环境应激具有重要意义.由于应用荧光素酶的成本低、应用范围广，所以被广泛应用于检测某些特殊细菌、厌氧微生物，监控生长缓慢的微生物，用于食品、饮料、自来水、化妆品、药物检测，河流水质、大气环境的监测。作为FL生产原料的萤火虫，要依靠人工捕捉或养殖，受地域和季节性限制，且该生物生产周期长、养殖成本高、提取的酶成分复杂，随着分子生物学的发展，人们转向用基因工程的方法进行生产。1985年，deWet，J.R.等首次克隆了P.Pyralis的FL基因，并在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达，从中得到具有活性的FL。1986 年，他们测定了FL基因的cDNA序列。随后，各种发光甲虫的FL基因相继克隆成功，并能在原核和真核表达系统中表达。取自P.Pyralis长约1.8kb的cDNA基因在E.coli表达的产物是分子量为62kD，含550个氨基酸的多肽链，与自然提取得到的FL相比，具有同样的反应动力学特性和发射波长，在相同的反应条件下酶的稳定性亦无差异。萤火虫荧光素酶基因通过克隆在E.coli表达，转化体在37℃、LB培养基中生长到对数后期收集菌体，用渗透压法、冻融法提取细菌胞质组分，经均质、离心，用凝胶排阻、离子交换色谱提取纯酶，冷冻干燥保存。BL可从培养发光细菌直接提取得到，其制备方法与FL类似。从V.harveyi中提取的酶活可达1.8×1011LU/mg，为获得特殊用途的BL，亦可通过诱变或基因克隆得到。各种发光细菌的基因克隆均有许多报道。Luciferase, firefly 是一种发光酶，负责萤火虫和磕头虫的生物发光。